Isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from dead edible fish in Iran

問題提起
非結核性マイコバクテリウム（NTM）は、水圏および陸圏環境に広く存在する環境由来の機会感染病原体であり、魚類と人間の両方にリスクをもたらす。魚結核（fish tuberculosis）は200種以上の魚類に影響を及ぼす肉芽腫性疾患であり、しばしば無気力、成長不良、臓器腫大、および死亡を引き起こす。Mycobacterium marinum、M. chelonae、および M. fortuitum が一般的な原因として知られているが、従来の表現型同定法は時間がかかり複雑であり、しばしば正確な種レベルの同定に失敗する。さらに、これらの病原体の人獣共通感染症としての潜在的可能性は、特にこれらがヒトへの感染源となり得る養殖システムにおいて、食用魚における迅速かつ正確な検出の必要性を浮き彫りにしている。

方法論
本研究では、2024年1月から2025年2月にかけてイラン西部のイラムにある様々な養殖池から回収された、死んだ食用魚のサンプル123検体におけるNTMの存在と特定を調査した。各池から健康な魚3匹を対照群とした。

• サンプル処理： 組織サンプルをホモジナイズし、抗酸菌染色用のチール・ネールゼン（ZN）染色を行い、NaOHおよびHClを用いて除菌を行った。
• 培養： 沈殿物をLowenstein-Jensen（LJ）培地に接種し、25°Cおよび37°Cの両方で8週間培養した。
• 表現型特性評価： 陽性コロニーについて、形態学的特徴、増殖速度、色素産生、およびCDCプロトコルに従った生化学的試験（ニアシン産生、硝酸塩還元、カタラーゼ、ウレアーゼ、およびアリルスルファターゼ活性）に基づき評価した。
• 分子同定： 市販のキットを用いてDNAを抽出した。種同定は、2つのハウスキーピング遺伝子であるhsp65遺伝子の441-bp断片およびrpoB遺伝子の750-bp断片のPCR増幅およびシーケンシングにより行った。
• 解析： シーケンシング結果は、NCBIデータベースに対するBLASTnを用いて解析した。系統樹は、MEGA 7ソフトウェアを用い、Kimura 2パラメータ（K2P）距離モデルと1000回のブートストラップ反復を用いた近隣結合法（NJ法）によって構築した。

主な結果

• 有病率： 123検体のうち19検体（15.44%）からNTMが分離された。すべての対照サンプルは陰性であった。
• 臨床症状： 感染した魚のうち、47.36%（9/19）は皮膚潰瘍を呈し、26.32%（5/19）は鱗の脱落を、5.26%（1/19）は重度の衰弱を呈し、21.05%（4/19）は臨床症状を示さなかった。
• 増殖特性： 分離株の73.68%（14/19）は急速増殖性マイコバクテリウム（RGM）であり、26.32%（5/19）は緩徐増殖性マイコバクテリウム（SGM）であった。
• 同定の不一致： 表現型法では14の分離株をM. fortuitum複合体として特定したが、7つのケース（当該複合体の53.8%）において種の判別に失敗した。
• 分子学的知見： hsp65遺伝子およびrpoB遺伝子のシーケンシングにより、正確な種判別が可能となった。hsp65遺伝子はrpoBよりも高い類似度を示した。最終的な種の分布は以下の通りである：
  • Mycobacterium fortuitum: 9分離株（47.36%）
  • Mycobacterium chelonae: 5分離株（26.32%）
  • Mycobacterium marinum: 5分離株（26.32%）
    （注：要旨のテキストには、要約の中で「M. fortuitum」を2回記載するという誤植があるが、詳細な結果と表1はM. chelonaeの存在を明確にしている）。

意義と主張
著者らは、本研究が、魚結核に関連する特定の臨床症状の頻度と分布について、従来の定性的記述と比較して、より包括的な定量的データを提供すると主張している。本研究は、表現型法が分離株のかなりの部分において種レベルの同定を実現できなかったという限界を強調しており、一方で分子生物学的手法は著しく高い精度を示すことが証明された。

本研究は、当該地域の食用魚が、魚類とヒトの両方に病原性を持つNTM種（M. fortuitum、M. chelonae、および M. marinum）を保有していると結論付けている。したがって、著者らは、ヒトの消費者への潜在的な健康被害を軽減し、魚類の疾病管理を改善するために、養殖システムにおける迅速かつ正確な分子検出法の導入の重要性を強調している。また、これらの病原体の疫学をより深く理解するために、さらなる分子生物学的研究を求めている。