In vitro evolution of uropathogenic Escherichia coli to fosfomycin resistance in a 3D cultured human bladder microtissue model

技術要約：3D培養ヒト膀胱マイクロ組織モデルにおける、ホスホマイシン耐性への尿路感染性大腸菌（UPEC）のin vitro進化

問題提起
現在の薬剤耐性（AMR）に関するin vitro研究は、主に実験室用培地に依存しており、これらは生体内（in vivo）の感染環境を正確に再現できていない。この乖離は、研究のトランスレーショナルな可能性を制限しており、実験室におけるAMRの獲得および進化を支配する条件が、臨床現場で見られるものと一致しない可能性がある。長期的な臨床分離株のコレクションは存在するが、それらは多くの場合、遡及的であり、コストが高く、入手が困難である。ホストと病原体の相互作用を研究するための3D培養モデルは存在するものの、AMRの獲得および進化の研究への応用は限定的である。治療中に耐性がどのように進化するかをより深く理解するために、ヒトの膀胱微小環境をシミュレートできる、生理学的に妥当なモデルに対する特定のニーズが存在する。

方法論
著者らは、7〜8層（基底層、中間層、および傘細胞層）に分層し、最大4週間にわたり100%ヒト尿に耐性を有する、ヒト膀胱尿路上皮を模倣したシステムである「3D尿耐性ヒト尿路上皮（3D-UHU）モデル」を利用した。

• 菌株： 一般的な尿路感染症（UTI）用抗菌薬に対する感受性に基づき、2種類の尿路感染性大腸菌（UPEC）臨床分離株、UTI-34（ST73）およびUTI-59（ST127）を選択した。
• 進化実験： 研究者らは、3D-UHUモデル内での実験的進化研究を実施した。細菌は、ホスホマイシンの取り込みを促進するためにグルコース-6-リン酸（UhpTトランスポーターを介した取り込みのため）を添加したプールされたヒト尿を含むアピカルチャンバー内で、増加する濃度のホスホマイシン（0.25x、0.5x、および1x MIC）に曝露された。
• 選択： 変異体は、ホスホマイシンを含む4倍および8倍のMICのMueller Hinton（MH）寒天培地上で回収された（変異体34Dはコンタミネーションとして除外された）。
• ゲノム解析： 先祖株および選択された変異体に対して、全ゲノムシーケンシング（IlluminaおよびOxford Nanopore）を実施した。変itsは、それぞれの先祖ゲノムに対するSnippyを用いてコールされた。
• 臨床的関連性のスクリーニング： 観察された変異を、BakRepデータベースから派生したヒト尿由来の14,163個の大腸菌ゲノムからなる精選されたデータセットに対してスクリーニングするためのバイオインフォマティクス・パイプラインを開発した。このスクリーニングには、完全一致（exact match）、領域一致（±20アミノ酸以内）、および遺伝子レベルの一致（gene-level match）という3段階のエビデンスシステムを用いた。
• 表現型特性評価： 最小発育阻止濃度（MIC）は、MH液体培地および条件付けられた尿の両方で決定された。セファレキシン、ニトロフラトール、およびトリメトプリムに対する側面的感受性（collateral susceptibility）は、ディスク拡散法により評価された。フィットネスは、MH液体培地における増殖曲線分析を通じて評価された。

主な結果

• 耐性の進化： 正常に回収されたすべてのホスホマイシン選択変異体は、ホスホマイシンに対して耐性を示した。
• 変異のランドスケープ：
  • UTI-34 変異体： 多様な変異パターンを示した。変異体は、glpT（欠失およびミスセンス）、uhpT（ナンセンス）、uhpC（ストップロス）、cyaA（ミスセンス）、およびptsI（フレームシフト）における変異を含んでいた。
  • UTI-59 変異体： より制約された進化を示した。すべての変異体（59Dを除く）は、glpTおよびuhpTにおけるフレームシフトを引き起こす単一塩基対の欠失を有していた。変異体59Dは、uhpAにおける9 bpのインフレーム欠失を含んでいた。
  • 共通性： すべての変異体は、臨床的なホスホマイシン耐性に関連することが知られている遺伝子（glpT, uhpT, uhpA, uhpC）に変異を持っていた。
• 臨床的関連性： ヒト尿中の大腸菌データセットに対するスクリーニングにより、観察された変異が臨床分離株を代表していることが確認された。
  • glpTおよびuhpAにおけるインフレーム欠失、uhpCにおけるストップロス、およびuhpTにおけるナンセンス変異について、完全一致が見出された。
  • ptsIおよびglpTにおけるフレームシフト、ならびにcyaAにおけるミスセンス変異について、領域一致および遺伝子レベルの一致が確認された。
  • これらの変異の発生頻度はデータセット内で異なり、glpTおよびuhpTにおけるフレームシフトはデータセット中で比較的一般的であった。
• 側面的影響（Collateral Effects）：
  • 変異体において、セファレキシンまたはニトロフラトールに対する統計的に有意な側面的耐性または感受性の変化は見られなかった。
  • UTI-34変異体において、トリメトプリムに対する感受性の統計的に有意な上昇が観察されたが、UTI-59変異体では観察されなかった。
• フィットネス：
  • UTI-34変異体は、変異体34Eを除き、一般的に担体容量（carrying capacity）およびAUC（曲線下面積）の有意な減少と、最大増殖速度の上昇を示した。
  • UTI-59変異体は、変異体59Bおよび59Cが減少したAUCと担体容量を示したものを除き、主に先祖株と比較してフィットネスパラメータに有意な差を示さなかった。

意義および主張
本論文は、3D-UHUモデルが、ヒトの膀胱に極めて近い生理学的に妥当な条件下でAMR獲得を研究するための実行可能なプラットフォームであることを提示している。本研究は、このモデルが、臨床分離株から見出されるものと区別がつかない臨床的に関連する変異を、尿路感染性大腸菌において選択できることを実証している。

著者らは、このような3Dマイクロ組織モデルを使用することで、AMR研究の臨床的関連性が向上し、感染の文脈において耐性がどのように獲得され、発現するかについてのより良い理解が得られると主張している。彼らは、このアプローチがAMRに対抗するための新しい戦略を報じる可能性を持っていると示唆している。本研究は「概念実証（proof-of-concept）」として提示されており、単一菌種（monoculture）ではなく多菌種コミュニティを使用している点や、限定的な分離株パネルを使用している点などの限界を認めている。著者らは、このモデルが臨床データを代替すると主張しているのではなく、遡及的な臨床研究に対して、耐性進化のメカニズムを調査するための制御された前向きな代替手段を提供するものであるとしている。