Genome-wide engineering for synthetic auxotrophy biocontainment in yeast

想象一个我们可以通过编程活细胞来执行各种惊人任务的世界，从清理石油泄漏到制造救命药物。这就是合成生物学的承诺。然而，将这些工程化的微生物释放到开放环境中带有显著风险：如果它们逃逸、大量繁殖并破坏自然生态系统，或者将其新性状转移给野生近亲，该怎么办？为了防止这种情况，科学家们正在开发“生物遏制”系统，本质上是遗传安全开关，确保这些生物只能在非常特定、受控的条件下生存。一种极具前景的策略是让微生物依赖于一种在自然界中并不存在的稀有构建模块。如果这种微生物离开实验室进入野外，它将无法找到这种缺失的成分，从而根本无法生存。

然而，挑战在于如何使这种安全开关既稳健，又不会在微生物执行任务时拖慢其速度。如果安全机制让微生物变得行动迟缓，它即使在实验室里也会难以竞争，或者更糟的是，它可能会进化出一种绕过安全开关的方法，以实现更快的生长。曼彻斯特大学、瓦赫宁根大学和 Inscripta Inc. 的研究团队致力于在酵母（一种广泛用于工业的常见单细胞真菌）中解决这一难题。他们的目标是创造一种酵母菌株，使其在自然界中完全无害，因为它需要一种特定的、非天然的氨基酸才能生存，但在提供该氨基酸时，其生长速度与正常的酵母细胞一样快。

为了实现这一目标，研究人员使用了名为“遗传密码扩增”的技术。在所有生物中，DNA 指令是以三个字母组成的组（称为密码子）进行读取的，这些密码子告诉细胞添加哪种氨基酸。其中一个密码子通常被称为“终止”信号，它告诉细胞停止构建蛋白质。团队用一个新的指令替换了这个终止信号，这个指令只有在存在特定的非天然氨基酸时才会起作用。他们将这种修改后的指令插入到必需基因中——这些基因至关重要，如果它们停止工作，酵母就会死亡。在存在非天然氨基酸的情况下，酵母的机制会忽略终止信号并构建出一个完整的、功能正常的蛋白质。在没有该氨基酸的情况下，机制会提前停止，产生一个破碎、无用的蛋白质，导致酵母死亡。

难点在于精确选择放置这个终止信号的位置。如果位置不对，酵母可能会在存在氨基酸的情况下也死亡，或者在没有氨基酸的情况下也能存活，因为破碎的蛋白质仍能发挥足够好的作用。为了找到完美的位置，研究人员并没有靠猜测，而是同时测试了数千种可能性。他们创建了一个庞大的酵母细胞库，其中每个细胞都携带一个带有不同位置终止信号的必需基因版本。他们使用高速机器人系统在近 400 种不同的必需蛋白质上进行了这些改变。

随后，团队在两种条件下培养了这数千种酵母变体：一种含有非天然氨基酸，另一种不含。通过追踪哪些遗传版本在每种环境下存活或消失，他们能够识别出最有效的安全开关。他们发现，开关的成功很大程度上取决于变化的特定位置和周围的遗传序列，而不仅仅是细胞通常制造多少该蛋白质。有趣的是，他们发现参与遗传信息处理（RNA 剪接）的基因是这种类型安全开关特别好的候选对象。

虽然他们找到了许多可以工作的单个开关，但没有一个是完美的。有些开关会阻止酵母生长得太好，而有些则不够严格，允许少数异常细胞在没有氨基酸的情况下存活。为了解决这个问题，研究人员将多个开关结合在一起。他们发现，在名为 PRP5 的必需基因中放置两个终止信号，可以创造出更严格的安全屏障。这种双开关菌株很难逃脱安全系统，大约每 10 万个细胞中仅有 2 个能实现在没有氨基酸的情况下存活。

为了进一步提升安全性，团队将这种氨基酸依赖性与第二个完全不同的安全系统相结合。第二个系统依赖于一种除非有特定激素存在否则就会解体的蛋白质。通过将氨基酸需求与这种蛋白质稳定性开关相结合，他们创造了一种具有极高安全性的酵母菌株。在测试中，这种双重锁定的酵母逃逸到野外并存活的可能性极低，估计不到 100 亿分之一。值得注意的是，这种极端的安全性并未以牺牲性能为代价；在实验室中，只要提供所需的成分，这些超安全的酵母细胞生长得和正常的野生酵母一样快且健康。

这项工作证明，构建具有既极其严格又不阻碍其功能的安全系统的真核生物（如酵母和人类细胞等复杂细胞）是可能的。通过仔细选择放置遗传变化的位置并叠加不同的安全机制，研究人员为新一代生物遏制技术奠定了基础。这种方法提供了一种让我们能够充满信心地在开放环境中利用工程化微生物的方式，因为一旦它们离开实验室，它们将无法生存。