Genome-wide engineering for synthetic auxotrophy biocontainment in yeast

Stellen Sie sich eine Welt vor, in der wir lebende Zellen so programmieren können, dass sie unglaubliche Aufgaben erfüllen, vom Reinigen von Ölverschmutzungen bis hin zur Herstellung lebensrettender Medikamente. Dies ist das Versprechen der synthetischen Biologie. Doch das Freisetzen dieser manipulierten Mikroben in die offene Umwelt birgt ein erhebliches Risiko: Was passiert, wenn sie entkommen, sich vermehren und natürliche Ökosysteme stören oder ihre neuen Eigenschaften auf wilde Verwandte übertragen? Um dies zu verhindern, entwickeln Wissenschaftler „Biocontainment“-Systeme – im Grunde genetische Sicherheitsschalter, die sicherstellen, dass diese Organismen nur unter sehr spezifischen, kontrollierten Bedingungen überleben können. Eine vielversprechende Strategie besteht darin, den Mikroben eine Abhängigkeit von einem seltenen Baustein aufzuerlegen, der in der Natur nicht vorkommt. Wenn der Mikrobe das Labor verlässt und in die Wildnis gelangt, kann er diesen fehlenden Inhaltsstoff nicht finden und kann schlichtweg nicht überleben.

Die Herausforderung besteht jedoch darin, diesen Sicherheitsschalter robust zu gestalten, ohne den Organismus bei der Ausführung seiner Aufgabe auszubremsen. Wenn der Sicherheitsmechanismus den Mikroben träge macht, wird er selbst im Labor Schwierigkeiten haben, sich durchzusetzen, oder schlimmer noch, er könnte einen Weg entwickeln, den Sicherheitsschalter zu umgehen, nur um schneller zu wachsen. Ein Forscherteam der University of Manchester, der Wageningen University und Inscripta Inc. machte sich daran, dieses Rätsel an Hefe zu lösen, einem häufig verwendeten einzelligen Pilz, der in der Industrie weit verbreitet ist. Ihr Ziel war es, einen Hefestamm zu erschaffen, der außerhalb des Labors völlig harmlos ist, da er eine spezifische, unnatürliche Aminosäure zum Überleben benötigt, aber genauso schnell wächst wie eine normale Hefezelle, wenn diese Aminosäure bereitgestellt wird.

Um dies zu erreichen, nutzten die Forscher eine Technik namens „Genetic Code Expansion“. In allen Lebewesen werden DNA-Anweisungen in Gruppen von drei Buchstaben gelesen, sogenannten Codons, die der Zelle mitteilen, welche Aminosäure hinzugefügt werden soll. Eines dieser Codons, das normalerweise als „Stopp“-Signal bezeichnet wird, sagt der Zelle, dass sie mit dem Aufbau des Proteins aufhören soll. Das Team ersetzte dieses Stopp-Signal durch eine neue Anweisung, die nur funktioniert, wenn eine spezifische unnatürliche Aminosäure vorhanden ist. Sie fügten diese modifizierte Anweisung in essenzielle Gene ein – Gene, die so kritisch sind, dass die Hefe stirbt, wenn sie nicht funktionieren. In Gegenwart der unnatürlichen Aminosäure ignoriert die Maschinerie der Hefe das Stopp-Signal und baut ein vollständiges, funktionierendes Protein auf. Oh\ne die Aminosäure bricht die Maschinerie vorzeitig ab, wodurch ein defektes, nutzloses Protein entsteht und die Hefe stirbt.

Die Schwierigkeit liegt darin, genau zu bestimmen, wo dieses Stopp-Signal platziert werden soll. Wird es an der falschen Stelle platziert, könnte die Hefe selbst dann sterben, wenn die Aminosäure vorhanden ist, oder sie könnte ohne sie überleben, weil das defekte Protein gut genug funktioniert. Um die perfekten Stellen zu finden, haben die Forscher nicht geraten; sie testeten tausende Möglichkeiten gleichzeitig. Sie erstellten eine riesige Bibliothek von Hefezellen, bei denen jede Zelle eine andere Version eines essenziellen Gens mit dem Stopp-Signal an einer anderen Position trug. Sie nutzten ein Hochgeschwindigkeits-Robotersystem, um diese Änderungen an fast 400 verschiedenen essenziellen Proteinen vorzunehmen.

Das Team züchtete diese tausenden Hefevarianten unter zwei Bedingungen: einer mit der unnatürlichen Aminosäure und einer ohne. Durch die Verfolgung dessen, welche genetischen Versionen in welcher Umgebung überlebten und welche verschwanden, konnten sie die effektivsten Sicherheitsschalter identifizieren. Sie fanden heraus, dass der Erfolg des Schalters stark von der spezifischen Position der Änderung und der umgebenden Gensequenz abhängt und nicht nur davon, wie viel Protein die Zelle normalerweise produziert. Interessanterweise entdeckten sie, dass Gene, die an der Verarbeitung genetischer Botschaften (RNA-Splicing) beteiligt sind, besonders gute Kandidaten für diese Art von Sicherheitsschalter waren.

Obwohl sie viele einzelne Schalter fanden, die funktionierten, war keiner von ihnen für sich allein perfekt. Einige verhinderten, dass die Hefe zu gut wuchs, während andere nicht streng genug waren und es einigen Ausreißerzellen ermöglichten, ohne die Aminosäure zu überleben. Um dies zu lösen, kombinierten die Forscher mehrere Schalter. Sie fanden heraus, dass das Platzieren von zwei Stopp-Signalen in einem einzigen essenziellen Gen, speziell in einem Gen namens PRP5, eine viel strengere Sicherheitsbarriere schuf. Dieser Doppel-Schalter-Stamm konnte das Sicherheitssystem nicht leicht umgehen, wobei nur etwa 2 von 100.000 Zellen es schafften, ohne die Aminosäure zu überleben.

Um die Sicherheit weiter zu erhöhen, legte das Team diese Aminosäureabhängigkeit mit einem zweiten, völlig anderen Sicherheitssystem. Dieses zweite System beruhte auf einem Protein, das auseinanderfällt, sofern kein spezifisches Hormon vorhanden ist. Durch die Kombination der Aminosäureanforderung mit diesem Proteinstabilitäts-Schalter schufen sie einen Hefestamm mit einem unglaublich hohen Sicherheitsniveau. In ihren Tests war die Wahrscheinlichkeit, dass diese doppelt gesicherte Hefe dem Sicherheitssystem entkam, um in der Wildnis zu überleben, so gering, dass sie nahezu unentdeckbar war – geschätzt auf weniger als 1 zu 10 Milliarden. Bemerkenswerterweise kam diese extreme Sicherheit nicht auf Kosten der Leistung; im Labor, wenn die erforderlichen Inhaltsstoffe vorhanden waren, wuchsen diese super-sicheren Hefezellen genauso schnell und gesund wie normale, wilde Hefe.

Diese Arbeit zeigt, dass es möglich ist, eukaryotische Organismen – komplexe Zellen wie Hefen und menschliche Zellen – mit Sicherheitssystemen zu bauen, die sowohl extrem streng als auch leistungsfähig sind. Durch die sorgfältige Auswahl der Position für genetische Änderungen und das Schichten verschiedener Sicherheitsmechanismen haben die Forscher den Grundstein für eine neue Generation des Biocontainments gelegt. Dieser Ansatz bietet eine Möglichkeit, manipulierte Mikroben mit Zuversicht in offenen Umgebungen einzusetzen, in dem Wissen, dass sie, sollten sie jemals das Labor verlassen, schlichtweg nicht überleben können.