Genome-wide engineering for synthetic auxotrophy biocontainment in yeast

私たちが、油流出の浄化から命を救う医薬品の製造に至るまで、驚くべきタスクを実行するように生きた細胞をプログラミングできる世界を想像してみてください。これが合成生物学が約束する未来です。しかし、これらの設計された微生物を開放的な環境に放出することには、重大なリスクが伴います。もしそれらが逃げ出し、増殖し、自然の生態系を混乱させたり、野生の近縁種に新しい形質を伝播させたりしたらどうなるでしょうか。これを防ぐために、科学者たちは「バイオコンテインメント（生物学的封じ込め）」システム、つまり、これらの生物が非常に特定の制御された条件下でのみ生存できるようにする、本質的に遺伝的な安全スイッチの開発を進めています。一つの有望な戦略は、微生物を自然界には存在しない希少な構成要素に依存させることです。もし微生物がラボを離れて野生に入れば、この足りない成分を見つけることができず、単に生存できなくなるのです。

しかし、課題は、この安全スイッチが微生物の仕事を遅らせることなく、いかに堅牢にするかという点にあります。もし安全メカニズムのせいで微生物の動きが鈍くなれば、ラボ内であっても競争力が低下しますし、さらに悪いことに、より速く成長するために安全スイッチを回避する方法を進化させてしまうかもしれません。マンチェスター大学、ワーゲニンゲン大学、およびInscripta Inc.の研究チームは、産業界で広く利用されている一般的な単細胞真菌である酵母を用いて、このパズルを解こうとしました。彼らの目的は、特定の非天然アミノ酸が存在する場合にのみ生存できる一方で、そのアミノ酸が提供されていれば通常の酵母と同じ速さで成長できる酵母の株を作り出すことでした。

これを実現するために、研究者たちは「遺伝暗号拡張」と呼ばれる技術を用いました。すべての生物において、DNAの指示は「コドン」と呼ばれる3文字のグループによって読み取られ、それが細胞にどののアミノ酸をタンパク質に加えるかを指示します。通常「ストップ」信号と呼ばれるこれらのコドンのうちの一つは、細胞にタンパク質の構築を停止するように伝えます。チームはこのストップ信号を、特定の非天然アミノ酸が存在する場合にのみ機能する新しい指示に置き換えました。彼らはこの修正された指示を、必須遺伝子（それらが機能しなければ酵母が死に至るほど極めて重要な遺伝子）の中に挿入しました。非天然アミノ酸が存在する場合、酵母の機構はそのストップ信号を無視して、完全で機能するタンパク質を構築します。アミノ酸がない場合、機構は途中で停止し、壊れた無用なタンパク質を作り出し、酵母は死滅します。

困難なのは、まさにどこにこのストップ信号を配置するかを選択することです。もし間違った場所に配置すれば、アミノ酸が存在する場合でも酵母が死んでしまうか、あるいは壊れたタンパク質が十分に機能してしまうために、アミノ酸なしでも生存してしまう可能性があります。最適な場所を見つけるために、研究者たちは推測するのではなく、一度に何千もの可能性をテストしました。彼らは、異なる位置にストップ信号を持つ異なるバージョンの必須遺伝子をそれぞれが持つ、膨大な酵母細胞のライブラリを作成しました。そして、高速ロボットシステムを使用して、これら約400種類の異なる必須タンパク質に対してこれらの変更を行いました。

チームは、これら数千種類の酵母変異体を、非天然アミノ酸がある条件とない条件の二つの環境下で培養しました。どの遺伝的バージョンがそれぞれの環境で生き残り、どのバージョンが消失したかを追跡することで、最も効果的な安全スイッチを特定することができました。彼らは、スイッチの成功が単に細胞が通常作るタンパク質の量ではなく、変更の具体的な位置や周囲の遺伝子配列に大きく依存していることを発見しました。興味深いことに、遺伝メッセージの処理（RNAスプライシング）に関わる遺伝子が、この種の安全スイッチにとって特に優れた候補であることが分かりました。

多くの個別のスイッチが見つかりましたが、単独で完璧なものは一つもありませんでした。中には酵母の成長を妨げてしまうものもあれば、厳格さが足りず、アミノ酸なしでも少数のローグ細胞が生存してしまうものもありました。これを解決するために、研究者たちは複数のスイッチを組み合わせました。彼らは、単一の必須遺伝子、具体的にはPRP5と呼ばれる遺伝子の中に二つのストップ信号を配置することで、より厳格な安全障壁を作り出せることを発見しました。このダブルスイッチ・スト strains は、安全システムから逃れることが非常に困難であり、アミノ酸なしで生存できる細胞はわずか10万個に約2個程度でした。

安全性をさらに高めるために、チームはこのアミノ酸依存性に、全く異なる第二の安全システムを重ね合わせました。この第二のシステムは、特定のホルモンが存在しない限り分解してしまうタンパク質に依存しています。このアミノ酸要求とタンパク質安定性スイッチを組み合わせることで、彼らは極めて高いセキュリティを備えた酵母株を作り上げました。テストにおいて、このダブルロックされた酵母が野生環境に逃げ出して生存する確率は、検出不可能に近いほど低く、100億個に1個未満であると推定されました。驚くべきことに、この極限の安全性はパフォーマンスを損なうことなく、ラボ内で必要な成分が存在する場合、これらの超安全な酵母は通常の野生酵母と同じくらい速く健康に成長しました。

この研究は、ユークリ真核生物（酵母やヒトの細胞のような複雑な細胞）を、極めて厳格でありながら機能を妨げない安全システムを備えた状態で構築できることを証明しています。遺伝的な変更を行う場所を慎重に選択し、異なる安全メカニズムを層状に重ねることで、研究者たちは次世代のバイオコンテインメントへの道筋をつけました。このアプローチは、設計された微生物がラボを離れたとしても、単に生存できなくなるという確信を持って、開放的な環境で設計された微生物を使用する方法を提供します。