Genome-wide engineering for synthetic auxotrophy biocontainment in yeast

Immaginate un mondo in cui possiamo programmare le cellule viventi per compiere compiti incredibili, dalla pulizia di fuoriuscite di petrolio alla produzione di medicinali salvavita. Questa è la promessa della biologia sintetica. Eppure, rilasciare questi microbi ingegnerizzati nell'ambiente aperto comporta un rischio significativo: cosa succederebbe se scappassero, si moltiplicassero e interrompessero gli ecosistemi naturali o trasferissero i loro nuovi tratti ai parenti selvatici? Per prevenire questo, gli scienziati stanno sviluppando sistemi di "biocontenimento", essenzialmente interruttori di sicurezza genetica che assicurano che questi organismi possano sopravvivere solo in condizioni molto specifiche e controllate. Una strategia promettente consiste nel rendere il microbo dipendente da un elemento costruttivo raro che non esiste in natura. Se il microbo lascia il laboratorio ed entra nel mondo naturale, non può trovare questo ingrediente mancante e semplicemente non può sopravvivere.

La sfida, tuttavia, consiste nel rendere questo interruttore di sicurezza robusto senza rallentare l'organismo mentre svolge il suo lavoro. Se il meccanismo di sicurezza rende il microbo pigro, farà fatica a competere anche in laboratorio, o peggio, potrebbe evolvere un modo per aggirare l'interruttore di sicurezza solo per crescere più velocemente. Un team di ricercatori dell'Università di Manchester, dell'Università di Wageningen e di Inscripta Inc. si è posto l'obiettivo di risolvere questo enigma nel lievito, un comune fungo unicellulare ampiamente utilizzato nell'industria. Miravano a creare un ceppo di lievito che fosse completamente innocuo al di fuori del laboratorio perché richiede un amminoacido specifico e innaturale per vivere, ma che cresca velocemente quanto un normale lievito quando viene fornito tale amminoacido.

Per raggiungere questo obiettivo, i ricercatori hanno utilizzato una tecnica chiamata espansione del codice genetico. In tutti gli esseri viventi, le istruzioni del DNA vengono lette in gruppi di tre lettere, chiamati codoni, che dicono alla cellula quale amminoacido aggiungere a una proteina. Uno di questi codoni, solitamente chiamato segnale di "stop", dice alla cell even di smettere di costruire la proteina. Il team ha sostituito questo segnale di stop con una nuova istruzione che funziona solo se è presente un amminoacido innaturale specifico. Hanno inserito questa istruzione modificata in geni essenziali — geni così critici che se smettono di funzionare, il lievito muore. In presenza dell'amminoacido innaturale, il macchinario del lievito ignora il segnale di stop e costruisce una proteina completa e funzionante. Senza l'amminoacido, il macchinario si ferma in anticipo, creando una proteina incompleta e inutile, e il lievito muore.

La difficoltà risiede nello scegliere esattamente dove posizionare questo segnale di stop. Se posizionato nel punto sbagliato, il lievito potrebbe morire anche in presenza dell'amminoacido, o potrebbe sopravvivere senza di esso perché la proteina difettosa funziona abbastanza bene. Per trovare i punti perfetti, i ricercatori non hanno tirato a indovinare; hanno testato migliaia di possibilità contemporaneamente. Hanno creato una vasta libreria di cellule di lievito, in cui ogni cellula trasportava una versione diversa di un gene essenziale con il segnale di stop posizionato in una posizione differente. Hanno utilizzato un sistema robotico ad alta velocità per apportare queste modifiche a quasi 400 diverse proteine essenziali.

Il team ha poi fatto crescere questi migliaia di varianti di lievito in due condizioni: una con l'amminoacido innaturale e una senza. Tracciando quali versioni genetiche sopravvivevano e quali scomparivano in ciascun ambiente, sono stati in grado di identificare gli interruttori di sicurezza più efficaci. Hanno scoperto che il successo dell'interruttore dipendeva fortemente dalla specifica posizione della modifica e dalla sequenza genetica circostante, piuttosto che da quanto la cellula producesse normalmente la proteina. Interessante è stato scoprire che i geni coinvolti nell'elaborazione dei messaggi genetici (splicing dell'RNA) erano candidati particolarmente validi per questo tipo di interruttore di sicurezza.

Sebbene avessero trovato molti interruttori individuali funzionanti, nessuno era perfetto da solo. Alcuni impedivano al lievito di crescere troppo bene, mentre altri non erano abbastanza rigorosi, permettendo ad alcune cellule ribelli di sopravvivere senza l'amminoacido. Per risolvere questo, i ricercatori hanno combinato più interruttori. Hanno scoperto che posizionare due segnali di stop in un singolo gene essenziale, specificamente in un gene chiamato PRP5, creava una barriera di sicurezza molto più rigorosa. Questo ceppo con doppio interruttore non poteva sfuggire facilmente al sistema di sicurezza, con solo circa 2 cellule su 100.000 che riuscivano a sopravvivere senza l'amminoacido.

Per spingere la sicurezza ancora oltre, il team ha stratificato questa dipendenza dall'amminoacido con un secondo sistema di sicurezza, completamente diverso. Questo secondo sistema si basava su una proteina che si disintegra a meno che non sia presente un ormone specifico. Combinando il requisito dell'amminoacido con questo interruttore di stabilità proteica, hanno creato un ceppo di lievito con un livello di sicurezza incredibilmente elevato. Nei loro test, la probabilità che questo lievito con doppia serratura sfuggisse per sopravvivere in natura era così bassa da essere quasi impercettibile, stimata in meno di 1 su 10 miliardi. Sorprendentemente, questa estrema sicurezza non è avvenuta a scapito delle prestazioni; in laboratorio, con gli ingredienti richiesti presenti, queste cellule di lievito super-sicure crescevano velocemente e sano come il normale lievito selvatico.

Questo lavoro dimostra che è possibile costruire organismi eucariotici — cellule complesse come il lievito e le cellule umane — con sistemi di sicurezza che siano estremamente rigorosi e che non ostacolino la loro capacità di funzionare. Scegliendo attentamente dove posizionare le modifiche genetiche e stratificando diversi meccanismi di sicurezza, i ricercatori hanno gettato le basi per una nuova generazione di biocontenimento. Questo approccio offre un modo per utilizzare microbi ingegnerizzati in ambienti aperti con fiducia, sapendo che se dovessero mai lasciare il laboratorio, saranno semplicemente incapaci di sopravvivere.