Genome-wide engineering for synthetic auxotrophy biocontainment in yeast

Stel je een wereld voor waarin we levende cellen kunnen programmeren om ongelooflijke taken uit te voeren, van het opruimen van olierampen tot de productie van levensreddende medicijnen. Dit is de belofte van synthetische biologie. Toch brengt het vrijlaten van deze gemanipuleerde microben in de open omgeving een aanzienlijk risico met zich mee: wat als ze ontsnappen, zich vermenigvuldigen en natuurlijke ecosystemen verstoren of hun nieuwe eigenschappen overdragen aan wilde verwanten? Om dit te voorkomen, ontwikkelen wetenschappers "biocontainment"-systemen, in feite genetische veiligheidsschakelaars die ervoor zorgen dat deze organismen alleen kunnen overleven onder zeer specifieke, gecontroleerde omstandigheden. Een veelbelovende strategie houdt in dat de microbe afhankelijk wordt gemaakt van een zeldzame bouwsteen die niet in de natuur voorkomt. Als de microbe het laboratorium verlaat en de wildernis binnengaat, kan hij deze ontbrekende ingrediënt niet vinden en kan hij simpelweg niet overleven.

De uitdaging is echter om deze veiligheidsschakelaar robuust te maken zonder het organisme te vertragen terwijl het zijn werk doet. Als het veiligheidsmechanisme de microbe traag maakt, zal hij zelfs in het laboratorium moeite hebben om te concurreren, of erger nog, hij zou een manier kunnen evolueren om de veiligheidsschakelaar te omzeilen, enkel om sneller te groeien. Een team van onderzoekers aan de Universiteit van Manchester, Wageningen University en Inscripta Inc. zette zich af om dit puzzelstukje op te lossen in gist, een veelvoorkomende eencellige schimmel die breed wordt gebruikt in de industrie. Ze streefden ernaar een stam gist te creëren die volledig ongevaarlijk is buiten het laboratorium omdat deze een specifieke, onnatuurlijke aminozuur nodig heeft om te leven, maar net zo snel groeit als een normale gistcel wanneer dat aminozuur wordt toegevoegd.

Om dit te bereiken, gebruikten de onderzoekers een techniek genaamd genetische code expansie. In alle levende wezens worden DNA-instructies gelezen in groepen van drie letters, genaamd codons, die de cel vertellen welk aminozuur er moet worden toegevoegd aan een eiwit. Een van deze codons, meestal een "stop"-signaal genoemd, vertelt de cel om met het bouwen van het eiwit te stoppen. Het team verving dit stop-signaal door een nieuwe instructie die alleen werkt als een specif으로 aminozuur aanwezig is. Ze plaatsten deze aangepaste instructie in essentiële genen—genen die zo cruciaal zijn dat als ze niet werken, de gist sterft. In aanwezigheid van het onnatuurlijke aminozuur negeert de machinerie van de gist het stop-signaal en bouwt het een volledig, werkend eiwit. Zonder het aminozuur stopt de machinerie voortijdig, wat resulteert in een defect, nutteloos eiwit, en de gist sterft.

De moeilijkheid ligt in het kiezen van de exacte plek waar dit stop-signaal geplaatst moet worden. Als het op de verkeerde plek wordt geplaatst, kan de gist zelfs bij de aanwezigheid van het aminozuur sterven, of kan hij zonder het aminozuur overleven omdat het defecte eiwit goed genoeg werkt. Om de perfecte locaties te vinden, gokten de onderzoekers niet; ze testten duizenden mogelijkheden tegelijkertijd. Ze creëerden een enorme bibliotheek van gistcellen, waarbij elke cel een andere versie van een essentieel gen droeg met het stop-signaal op een andere locatie geplaatst. Ze gebruikten een hogesnelheidsrobotisch systeem om deze veranderingen aan te brengen in bijna 400 verschillende essentiële eiwitten.

Het team kweekte deze duizenden gistvarianten in twee condities: één met het onnatuurlijke aminozuur en één zonder. Door bij te houden welke genetische versies overleefden en welke verdwenen in elk milieu, konden ze de meest effectieve veiligheidsschakelaars identificeren. Ze ontdekten dat het succes van de schakelaar sterk afhing van de specifieke locatie van de verandering en de omliggende genetische sequentie, in plaats van alleen van hoeveel van het eiwit de cel gewoonlijk produceerde. Interessant genoeg ontdekten ze dat genen betrokken bij de verwerking van genetische boodschappen (RNA-splicing) bijzonder goede kandidaten waren voor dit type veiligheidsschakelaar.

Hoewel ze veel individuele schakelaars vonden die werkten, was er geen enkele die perfect was op zichzelf. Sommige stopten de groei van de gist te veel, terwijl andere niet strikt genoeg waren, waardoor een paar rogue cellen zonder het aminozuur konden overleven. Om dit op te lossen, combineerden de onderzoekers meerdere schakelaars. Ze ontdekten dat het plaatsen van twee stop-signalen in een enkel essentieel gen, specifiek in een gen genaamd PRP5, een veel striktere veiligheidsbarrière creëerde. Deze dubbel-schakelaar stam kon het veiligheidssysteem niet gemakkelijk omzeilen, waarbij slechts ongeveer 2 op de 100.000 cellen erin slaagden om zonder het aminozuur te overleven.

Om de veiligheid verder te vergroten, voegde het team de aminozuurafhankelijkheid toe aan een tweede, totaal ander veiligheidssysteem. Dit tweede systeem vertrouwde op een eiwit dat uit elkaar valt tenzij een specifiek hormoon aanwezig is. Door de aminozuurvereiste te combineren met deze eiwitstabiliteitsschakelaar, creëerden ze een giststam met een ongelooflijk hoog beveiligingsniveau. In hun tests was de kans dat deze dubbel vergrendelde gist ontsnapte om in het wild te overleven zo laag dat deze bijna ondetecteerbaar was, geschat op minder dan 1 op de 10 miljard. BRemarkabel genoeg kwam deze extreme veiligheid niet ten koste van de prestaties; in het laboratorium, met de vereiste ingrediënten aanwezig, groeiden deze superveilige gistcellen net zo snel en gezond als normale, wilde gist.

Dit werk demonstreert dat het mogelijk is om eukaryote organismen te bouwen—complexe cellen zoals gist en menselijke cellen—met veiligheidssystemen die zowel extreem strikt zijn als niet hinderlijk zijn voor hun vermogen om te functioneren. Door zorgvuldig te selecteren waar genetische veranderingen geplaatst moeten worden en door verschillende veiligheidsmechanismen te combineren, hebben de onderzoekers de basis gelegd voor een nieuwe generatie biocontainment. Deze aanpak biedt een manier om gemanipuleerde microben met vertrouwen in open omgevingen te gebruiken, wetende dat als ze ooit het laboratorium verlaten, ze simpelweg niet in staat zullen zijn om te overleven.