Genome-wide engineering for synthetic auxotrophy biocontainment in yeast

Imagine um mundo onde possamos programar células vivas para realizar tarefas incríveis, desde limpar derramamentos de óleo até fabricar medicamentos que salvam vidas. Esta é a promessa da biologia sintética. No entanto, liberar esses micróbios modificados no ambiente aberto carrega um risco significativo: e se eles escaparem, se multiplicarem e perturbarem ecossistemas naturais ou transferirem seus novos traços para parentes selvagens? Para prevenir isso, cientistas estão desenvolvendo sistemas de "biocontenção", essencialmente interruptores de segurança genética que garantem que esses organismos possam sobreviver apenas sob condições muito específicas e controladas. Uma estratégia promissora envolve tornar o micróbio dependente de um bloco de construção raro que não existe na natureza. Se o micróbio deixar o laboratório e entrar no mundo selvagem, ele não conseguirá encontrar esse ingrediente ausente e simplesmente não conseguirá sobreviver.

O desafio, contudo, é tornar esse interruptor de segurança robusto sem retardar o organismo enquanto ele realiza seu trabalho. Se o mecanismo de segurança tornar o micróbio lento, ele terá dificuldade em competir mesmo no laboratório ou, pior, poderá evoluir uma maneira de contornar o interruptor de segurança apenas para crescer mais rápido. Uma equipe de pesquisadores da Universidade de Manchester, da Universidade de Wageningen e da Inscripta Inc. propôs-se a resolver este quebra-cabeça na levedura, um fungo unicelular comum usado amplamente na indústria. Eles visavam criar uma linhagem de levedura que fosse completamente inofensiva fora do laboratório porque requer um aminoácido não natural específico para viver, mas que cresça tão rápido quanto uma célula de levedura normal quando esse aminoácido é fornecido.

Para alcançar isso, os pesquisadores utilizaram uma técnica chamada expansão do código genético. Em todos os seres vivos, as instruções do DNA são lidas em grupos de três letras, chamados códons, que dizem à célula qual aminoácido adicionar a uma proteína. Um desses códons, geralmente chamado de sinal de "parada" (stop), diz à célula para parar de construir a proteína. A equipe substituiu este sinal de parada por uma nova instrução que só funciona se um aminoácido não natural específico estiver presente. Eles inseriram essa instrução modificada em genes essenciais — genes tão críticos que, se pararem de funcionar, a levedura morre. Na presença do aminoácido não natural, a maquinaria da levedura ignora o sinal de parada e constrói uma proteína completa e funcional. Sem o aminoácido, a maquinaria para precocemente, criando uma proteína quebrada e inútil, e a levedura morre.

A dificuldade reside em escolher exatamente onde colocar este sinal de parada. Se colocado no lugar errado, a levedura pode morrer mesmo quando o aminoácido está presente, ou pode sobreviver sem ele porque a proteína quebrada ainda funciona bem o suficiente. Para encontrar os locais perfeitos, os pesquisadores não adivinharam; eles testaram milhares de possibilidades de uma só vez. Eles criaram uma biblioteca massiva de células de levedura, onde cada célula carregava uma versão diferente de um gene essencial com o sinal de parada colocado em um local diferente. Eles usaram um sistema robótico de alta velocidade para realizar essas mudanças em quase 400 proteínas essenciais diferentes.

A equipe então cultivou esses milhares de variantes de levedura em duas condições: uma com o aminoácido não natural e outra sem ele. Ao rastrear quais versões genéticas sobreviveram e quais desapareceram em cada ambiente, eles puderam identificar os interruptores de segurança mais eficazes. Eles descobriram que o sucesso do interruptor dependia fortemente da localização específica da mudança e da sequência genética circundante, e não apenas de quanto a célula normalmente produzia da proteína. Curiosamente, descobriram que genes envolvidos no processamento de mensagens genéticas (splicing de RNA) eram candidatos particularmente bons para este tipo de interruptor de segurança.

Embora tenham encontrado muitos interruptores individuais que funcionavam, nenhum era perfeito por si só. Alguns impediam a levedura de crescer muito bem, enquanto outros não eram rigorosos o suficiente, permitindo que algumas células rebeldes sobrevivessem sem o aminoácido. Para resolver isso, os pesquisadores combinaram múltiplos interruptores. Eles descobriram que colocar dois sinais de parada em um único gene essencial, especificamente em um gene chamado PRP5, criava uma barreira de segurança muito mais rigorosa. Esta linhagem de duplo interruptor não conseguia escapar do sistema de segurança facilmente, com apenas cerca de 2 em cada 100.000 células conseguindo sobreviver sem o aminoácido.

Para levar a segurança ainda mais longe, a equipe sobrepôs essa dependência de aminoácidos com um segundo sistema de segurança completamente diferente. Este segundo sistema dependia de uma proteína que se desintegra a menos que um hormônio específico esteja presente. Ao combinar a exigência do aminoácido com este interruptor de estabilidade proteica, eles criaram uma linhagem de levedura com um nível de segurança incrivelmente alto. Em seus testes, a chance de esta levedura de duplo bloqueio escapar para sobreviver no mundo selvagem era tão baixa que era quase indetectável, estimada em menos de 1 em 10 bilhões. Surpreendentemente, esta segurança extrema não veio à custa do desempenho; no laboratório, com os ingredientes necessários presentes, essas células de levedura superseguras cresciam tão rápido e saudáveis quanto a levedura selvagem normal.

Este trabalho demonstra que é possível construir organismos eucarióticos — células complexas como leveduras e células humanas — com sistemas de segurança que sejam simultaneamente extremamente rigorosos e que não prejudiquem sua capacidade de funcionar. Ao selecionar cuidadosamente onde colocar as mudanças genéticas e ao sobrepor diferentes mecanismos de segurança, os pesquisadores lançaram as bases para uma nova geração de biocontenção. Esta abordagem oferece uma maneira de usar micróbios modificados em ambientes abertos com confiança, sabendo que, se eles algum dia deixarem o laboratório, serão simplesmente incapazes de sobreviver.