High-throughput serial two-photon tomography with BakingTray and BrainSaw

لفهم الدماغ، يجب على العلماء رؤيته في ثلاثة أبعاد. فالدماغ ليس خريطة مسطحة، بل هو غابة كثيفة ومتشابكة من الروابط التي تمتد عبر حجم من الأنسجة. لعقود من الزمن، كافح الباحثون لالتقاط هذا الحجم الكامل دون تدمير العلاقات ذاتها التي يسعون لدراستها. غالبًا ما تتضمن الطرق التقليدية تقطيع الدماغ إلى شرائح رقيقة، وتثبيتها على شرائح زجاجية، ومحاولة إعادة تجميع اللغز لاحقًا. هذه العملية محفوفة بالمشاكل: فالشرائح الرقيقة يمكن أن تتمزق أو تلتوي أو تضيع، مما يكسر القصة المستمرة لكيفية اتصال جزء من الدماغ بجزء آخر. وبينما توجد تقنيات أخرى لجعل الأنسجة شفافة وتصويرها كاملة، إلا أنها غالبًا ما تتطلب معالجات كيميائية معقدة تستغرق أساباء وتتطلب معدات متخصصة. هناك حاجة إلى طريقة سريعة، وموثوقة، وقادرة على التعامل مع عينات عديدة في وقت واحد، مما يسمح للعلماء برسم بنية الدماغ بدقة عالية مع الحفاظ على سلامة الأنسجة أثناء عملية التصوير.

لقد طور فريق من الباحثين حلاً يجمع بين تقنية تصوير قوية ومنصة برمجية جديدة مفتوحة المصدر لجعل هذا الأمر ممكنًا. أطلقوا على نظامهم اسم "BrainSaw" (منشار الدماغ)، وهو اسم يعكس وظيفته: فهو يقطع الدماغ ويصوره في آن واحد. تعتمد التقنية الجوهرية على مجهر ثنائي الفوتون، الذي يستخدم شعاعًا ضوئيًا مركزًا للرؤية في عمق الأنسجة، مقترنًا بجهاز "vibratome"، وهو جهاز يقطع شرائح رقيقة من الأنسجة. وبدلاً من إزالة الشرائح، يقوم النظام بتصوير السطح الطازج والمكشوف للكتلة بعد كل عملية قطع. وبينما يلتقط المجهر صورة للسطح، تقوم الآلة بقطع تلك الطبقة، لتكشف عن سطح جديد تحتها، وتتكرر العملية آلاف المرات. هذا يخلق فيلمًا سلسًا ثلاثي الأبعاد للعضو بأكគេ. والابتكار في هذا العمل لا يقتصر على الأجهزة فحسب، بل يمتد إلى البرمجيات التي تتحكم فيها، والتي تسمى "BakingTray". يعمل هذا البرنامج بمثابة المايسترو، حيث يخبر المجهر متى يقوم بالمسح الضوئي، ومتى يقطع، وكيف يجمع ملايين الصور معًا في مجموعة بيانات ثلاثية الأبعاد واحدة قابلة للاستخدام.

قام الباحثون ببناء اثني عشر نظامًا من هذه الأنظمة حول العالم، بدءًا من عام 2016، وقد وضعوها قيد العمل في مرفق مزدحم في مركز "Sainsbury Wellcome" في لندن. وعلى مر السنين، قامت هذه الآلات بتصوير أكثر من 7,000 عينة، مما ساهم في عشرات الأوراق العلمية. تم تصميم هذه الآلات لتكون قوية بما يكفي لتعمل دون مراقبة لساعات، وغالبًا طوال الليل، مما يسمح للباحثين بمعالجة أدمغة متعددة في جلسة واحدة. كما أن البرنامج مرن بما يكفي للتعامل مع أنواع مختلفة من المجاهر وإعدادات الأجهزة، مما يعني أن المختبرات يمكنها بناء أنظمتها الخاصة أو تحويل المجاهر الموجودة إلى أجهزة تصوير عالية الإنتاجية. وقد أثبت الفريق أن النظام موثوق، حيث تكتمل الغالبية العظمى من جلسات التصوير دون الحاجة إلى إعادة تشغيل. وعندما تحدث انقطاعات، فغالبًا ما تكون بسبب أخطاء بشرية بسيطة أو مشكلات تقنية متوقعة، وقد صُمم النظام لاستئناف العمل بسرعة، غالبًا في غضون ساعة واحدة.

تتجلى قوة هذا النهج في أفضل صورها فيما يسمح به للعلماء. أحد التطبيقات الرئيسية هو تحديد المسار الدقيق لقطب كهربائي تم إدخاله في دماغ حيوان حي لتسجيل النشاط. ومن خلال غمس القطب في صبغة فلورية قبل إدخاله، يترك خلفه أثرًا يتوهج تحت المجهر. يمكن لـ "BrainSaw" تصوير الدماغ بأكمله، وتتبع الصبغة، ورسم الخريطة الدقيقة لموقع التسجيل في ثلاثة أبعاد، مما يزيل التخمين بشأن مصدر البيانات. استخدام رئيسي آخر هو عد الخلايا؛ حيث يمكن للنظام تصوير دماغ كامل بدقة كافية لرؤية أجسام الخلايا الفردية، ويمكن للبرامج الآلية بعد ذلك عد كل عصبون معلم في العضو بأكمله. وهذا يسمح للباحثين بمقارنة أعداد الخلايا عبر حيوانات أو مناطق دماغية مختلفة بمستوى من التفصيل كان من المستحيل تحقيقه سابقًا على نطاق واسه.

وبعيدًا عن مجرد العد والتتبع، يكشف النظام عن كيفية اتصال أنواع مختلفة من خلايا الدماغ ببعضها البعض. في إحدى التجارب، استهدف الباحثون عصبونات تثبيطية محددة في منطقة صغيرة من الدماغ تسمى "الجسد المخطط الركبي البطني الجانبي" (ventral lateral geniculate nucleus). استخدموا فيروسًا لجعل هذه العصبونات تتوهج ولتمييز نهاياتها المشبكية، وهي النقاط الصغيرة التي تتواصل فيها مع الخلايا الأخرى. ومن خلال تصوير الدماغ بأكمله، استطاعوا رؤية ليس فقط أين ترسل هذه العصبونات محاورها الطويلة، بل وأين تشكلت تلك المحاور اتصالاتات بالضبط. لقد وجدوا أن الأنواع الفرعية المختلفة من هذه العصبونات، حتى عندما تقع في نفس المنطقة الصغيرة، تمتد إلى أجزاء مختلفة من الدماغ وتشكل اتصالات بأنماط متميزة. هذا النوع من الخرائط التفصيلية يساعد العلماء على فهم كيفية بناء دوائر عصبية معينة وكيفية عملها.

كما أن التقنية متنوعة بما يكفي للتعامل مع الأنسجة التي تم صبغها بعد موت الحيوان. أظهر الباحثون أنه يمكنهم تصوير أدمغة من نموذج فأر مصاب بمرض ألزهايمر، والتي عولجت بصبغة لتسليط الضوء على لويحات الأميلويد، وهي تجمعات البروتين المرتبطة بالمرض. وعلى الرغم من ضرورة معالجة الأنسجة كيميائيًا لتصبح مستجيبة للصبغة، إلا أن النظام كان لا يزال قادرًا على تصوير الدماغ بأكمله، كاشفًا عن التوزيع الواسع لهذه اللويحات. وهذا يوضح أن الطريقة ليست مقتصرة على الحيوانات المعدلة وراثيًا، بل يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية، من دراسة الجهاز المناعي في الطحال إلى رسم خريطة انتشار المرض.

يعتمد نجاح المشروع بشكل كبير على البرمجيات، وهي مجانية ومفتوحة ليستخدمها أي شخص. ويؤكد المؤلفون أنه بينما تتطلب الأجهزة مهارة للبناء والصيانة، فإن البرمجيات تزيل حاجز الحاجة إلى كود برمجي مخصص لكل إعداد جديد. فهي تسمح لمجتمع من الباحثين بمشاركة التصاميم والتحسينات، مما يخلق طريقة معيارية لأداء مهام التصوير المعقدة هذه. النظام ليس مثاليًا؛ فهو لا يستطيع تصوير دماغ حيوان أكبر بكثير مثل ابن عرس لأن الغطاء الخارجي الصلب للدماغ يصعب قطعه، كما أنه ليس مصممًا للتكبير الشديد اللازم لتتبع محور واحد وصولًا إلى أدق فروعه. ومع ذلك، بالنسبة للغالبية العظمى من الأسئلة المتعلقة بعلم الأعصاب التي تتطلب رؤية للدماغ بأكمله، فإنه يوفر مسارًا سريعًا وموثوقًا وسهل الوصول. ومن خلال تحويل عملية معقدة ومدمرة إلى سير عمل مؤتمت ومنظم، جعل "BrainSaw" و"BakingTray" من الممكن لمزيد من العلماء استكشاف الدماغ في ثلاثة أبعاد، محولين المهمة المستحيلة المتمثلة في رسم خريطة العضو بأكمله إلى جزء روتيني من الأبحاث الحديثة.