High-throughput serial two-photon tomography with BakingTray and BrainSaw

Per comprendere il cervello, gli scienziati devono vederlo in tre dimensioni. Il cervello non è una mappa piatta, ma una fitta e aggrovigliata foresta di connessioni che si estende attraverso un volume di tessuto. Per decenni, i ricercatori hanno lottato per catturare questo intero volume senza distruggere proprio le relazioni che cercano di studiare. I metodi tradizionali spesso prevedono di affettare il cervello in sottili fogli, montarli su vetrini di vetro e cercare di riassemblare il puzzle in un secondo momento. Questo processo è pieno di problemi: le fette delicate possono strapparsi, deformarsi o andare perdute, interrompendo la storia continua di come una parte del cervello si connette a un'altra. Sebbene esistano altre tecniche per rendere il tessuto trasparente e immaginarlo intero, esse richiedono spesso trattamenti chimici complessi che durano settimane e richiedono attrezzature specializzate. C'è bisogno di un metodo che sia veloce, affidabile e capace di gestire molti campioni contemporaneamente, permettendo agli scienziati di mappare l'architettura del cervello con alta precisione mantenendo intatto il tessuto durante il processo di imaging.

Un team di ricercatori ha sviluppato una soluzione che combina una potente tecnica di imaging con una nuova piattaforma software open-source per rendere possibile questo obiettivo. Chiamano il loro sistema "BrainSaw", un nome che riflette la sua funzione: affetta e immagina il cervello simultaneamente. La tecnologia centrale si basa su un microscopio a due fotoni, che utilizza un fascio di luce focalizzato per vedere in profondità all'interno del tessuto, accoppiato a un vibratomo, un dispositivo che taglia sottili fette di tessuto. Invece di rimuovere le fette, il sistema immagina la superficie fresca ed esposta del blocco dopo ogni taglio. Mentre il microscopio cattura l'immagine della superficie, la macchina taglia via quello strato, rivelando una nuova superficie sottostante, e il processo si ripete migliaia di volte. Questo crea un film tridimensionale continuo dell'intero organo. L'innovazione in questo lavoro non è solo l'hardware, ma il software che lo controlla, chiamato BakingTray. Questo software agisce come il direttore d'orchestra, dicendo al microscopio quando scansionare, quando tagliare e come cucire insieme i milioni di immagini in un singolo dataset 3D utilizzabile.

I ricercatori hanno costruito dodici di questi sistemi in tutto il mondo, iniziando nel 2016, e li hanno messi al lavoro in una struttura molto attiva presso il Sainsbury Wellcome Centre di Londra. Negli anni, queste macchine hanno immagiato più di 7.000 campioni, contribuendo a decine di articoli scientifici. Il sistema è progettato per essere abbastanza robusto da poter funzionare senza supervisione per ore, spesso durante la notte, permettendo ai ricercatori di elaborare più cervelli in una singola sessione. Il software è abbastanza flessibile da gestire diversi tipi di microscopi e configurazioni hardware, il che significa che i laboratori possono costruire i propri sistemi o convertire i microscopi esistenti in questi imager ad alto rendimento. Il team ha dimostrato che il sistema è affidabile, con la stragrande maggioranza delle sessioni di imaging che si completa senza necessità di riavvio. Quando si verificano interruzioni, sono solitamente dovute a semplici errori dell'utente o a intoppi tecnici prevedibili, e il sistema è progettato per riprendere rapidamente, spesso entro un'ora.

La potenza di questo approccio è meglio vista in ciò che permette agli scienziati di fare. Una grande applicazione è localizzare il percorso preciso di un elettrodo che è stato inserito nel cervello di un animale vivente per registrare l'attività. Immergendo l'elettrodo in un colorante fluorescente prima dell'inserimento, la traccia che esso lascia dietro di sé brilla sotto il microscopio. Il BrainSaw può immaginare l'intero cervello, tracciare il colorante e mappare l'esatta posizione del sito di registrazione in tre dimensioni, eliminando le congetture su da dove provenissero i dati. Un altro uso chiave è il conteggio delle cellule. Il sistema può immaginare un intero cervello con una risoluzione abbastanza fine da vedere i singoli corpi cellulari, e un software automatizzato può quindi contare ogni neurone marcato nell'intero organo. Ciò consente ai ricercatori di confrontare il numero di cellule tra diversi animali o regioni cerebrali con un livello di dettaglio che prima era impossibile da raggiungere su larga scala.

Oltre al semplice conteggio e tracciamento, il sistema rivela come diversi tipi di cellule cerebrali si connettono tra loro. In un esperimento, i ricercatori hanno preso di mira specifici neuroni inibitori in una piccola regione del cervello chiamata nucleo genicolato laterale ventrale. Hanno usato un virus per far brillare questi neuroni e per marcare i loro terminali sinaptici, i piccoli punti in cui comunicano con altre cellule. Immaginando l'intero cervello, hanno potuto vedere non solo dove i neuroni inviano i loro lunghi assoni, ma esattamente dove quegli assoni formano connessioni. Hanno scoperto che diversi sottotipi di questi neuroni, anche quando si trovano nella stessa piccola area, si proiettano in parti diverse del cervello e formano connessioni in schemi distinti. Questo tipo di mappatura dettagliata aiuta gli scienziati a capire come vengono costruiti i circuiti specifici e come potrebbero funzionare.

La tecnica è anche abbastanza versatile da gestire tessuti che sono stati colorati dopo la morte dell'animale. I ricercatori hanno dimostrato di poter immaginare cervelli di un modello murino di Alzheimer che erano stati trattati con un colorante per evidenziare le placche amiloidi, i grumi di proteine associati alla malattia. Anche se il tessuto doveva essere trattato chimicamente per renderlo ricettivo alla colorazione, il sistema è stato comunque in grado di immaginare l'intero cervello, rivelando la distribuzione diffusa di queste placche. Ciò dimostra che il metodo non è limitato agli animali geneticamente modificati, ma può essere applicato a una vasta gamma di domande biologiche, dallo studio del sistema immunitario nella milza alla mappatura della diffusione delle malattie.

Il successo del progetto si basa pesantemente sul software, che è gratuito e aperto a chiunque voglia usarlo. Gli autori sottolineano che, sebbene l'hardware richieda abilità per essere costruito e mantenuto, il software rimuove la barriera del bisogno di codice personalizzato per ogni nuova configurazione. Permette a una comunità di ricercatori di condividere progetti e miglioramenti, creando uno standard per eseguire questi complessi compiti di imaging. Il sistema non è perfetto; non può immaginare il cervello di un animale molto più grande come un ferretto, perché la dura copertura esterna del cervello è troppo difficile da tagliare, e non è progettato per l'ingrandimento estremo necessario per tracciare un singolo assone fino alla sua ramificazione più fine. Tuttavia, per la stragrande maggioranza delle questioni neuroscientifiche che richiedono una visione dell'intero cervello, offre una via avanti veloce, affidabile e accessibile. Trasformando un processo complesso e distruttivo in un flusso di lavoro snello e automatizzato, il BrainSaw e BakingTray hanno reso possibile per più scienziati esplorare il cervello in tre dimensioni, trasformando l'impossibile compito di mappare l'intero organo in una parte routinaria della ricerca moderna.