High-throughput serial two-photon tomography with BakingTray and BrainSaw

Para compreender o cérebro, os cientistas precisam vê-lo em três dimensões. O cérebro não é um mapa plano, mas uma floresta densa e emaranhada de conexões que se estende por um volume de tecido. Durante décadas, os pesquisadores lutaram para capturar todo esse volume sem destruir as próprias relações que buscam estudar. Os métodos tradicionais frequentemente envolvem fatiar o cérebro em folhas finas, montá-las em lâminas de vidro e tentar remontar o quebra-cabeça posteriormente. Esse processo é repleto de problemas: as fatias delicadas podem rasgar, deformar ou se perder, quebrando a história contínua de como uma parte do cérebro se conecta a outra. Embora existam outras técnicas para tornar o tecido transparente e imaginá-lo por inteiro, elas geralmente exigem tratamentos químicos complexos que levam semanas e demandam equipamentos especializados. Há uma necessidade de um método que seja rápido, confiável e capaz de lidar com muitas amostras ao mesmo tempo, permitendo que os cientistas mapeiem a arquitetura do cérebro com alta precisão enquanto mantêm o tecido intacto durante o processo de imagem.

Uma equipe de pesquisadores desenvolveu uma solução que combina uma poderosa técnica de imagem com uma nova plataforma de software de código aberto para tornar isso possível. Eles chamam seu sistema de "BrainSaw", um nome que reflete sua função: ele fatia e imagina o céreamente simultaneamente. A tecnologia central baseia-se em um microscópio de dois fótons, que utiliza um feixe de luz focado para enxergar profundamente dentro do tecido, pareado com um vibrátomo, um dispositivo que corta fatias finas de tecido. Em vez de remover as fatias, o sistema imagia a superfície fresca e exposta do bloco após cada corte. À medida que o microscópio captura a imagem da superfície, a máquina fatia essa camada, revelando uma nova superfície por baixo, e o processo se repete milhares de vezes. Isso cria um filme tridimensional contínuo de todo o órgão. A inovação neste trabalho não é apenas o hardware, mas o software que o controla, chamado BakingTray. Este software atua como o maestro, dizendo ao microscópio quando escanear, quando cortar e como costurar os milhões de imagens em um único conjunto de dados 3D utilizável.

Os pesquisadores construíram doze desses sistemas ao redor do mundo, começando em 2016, e os colocaram para trabalhar em uma instalação movimentada no Sainsbury Wellcome Centre, em Londres. Ao longo dos anos, essas máquinas imaginaram mais de 7.000 amostras, contribuindo para dezenas de artigos científicos. O sistema é projetado para ser robusto o suficiente para funcionar sem supervisão por horas, frequentemente durante a noite, permitindo que os pesquisadores processem múltiplos cérebros em uma única sessão. O software é flexível o suficiente para lidar com diferentes tipos de microscópios e configurações de hardware, o que significa que os laboratórios podem construir seus próprios sistemas ou converter microscópios existentes em esses imaginadores de alto rendimento. A equipe demonstrou que o sistema é confiável, com a grande maioria das sessões de imagem completando-se sem a necessidade de reiniciar. Quando ocorrem interrupções, elas são geralmente causadas por erros simples do usuário ou contratempos técnicos previsíveis, e o sistema é projetado para retomar rapidamente, muitas vezes em menos de uma hora.

O poder desta abordagem é melhor visto no que ela permite aos cientistas fazer. Uma grande aplicação é localizar o caminho preciso de um eletrodo que foi inserido no cérebro de um animal vivo para registrar atividade. Ao mergulhar o eletrodo em um corante fluorescente antes da inserção, o rastro que ele deixa para trás brilha sob o microscópio. O BrainSaw pode imaginar o cérebro inteiro, rastrear o corante e mapear a localização exata do local de registro em três dimensões, removendo o elemento de adivinhação sobre de onde os dados vieram. Outro uso fundamental é a contagem de células. O sistema pode imaginar um cérebro inteiro com uma resolução fina o suficiente para ver corpos celulares individuais, e um software automatizado pode então contar cada neurônio marcado em todo o órgão. Isso permite que os pesquisadores comparem números de células entre diferentes animais ou regiões cerebrais com um nível de detalhe que era anteriormente impossível de alcançar em escala.

Além da simples contagem e rastreamento, o sistema revela como diferentes tipos de células cerebrais se conectam umas às outras. Em um experimento, os pesquisadores focaram em neurônios inibitórios específicos em uma pequena região do cérebro chamada núcleo geniculado lateral ventral. Eles usaram um vírus para fazer esses neurônios brilharem e para marcar seus terminais sinápticos, os minúsculos pontos onde eles se comunicam com outras células. Ao imaginar o cérebro inteiro, eles puderam ver não apenas para onde os neurônios enviam seus axônios longos, mas exatamente onde esses axônios formam conexões. Eles descobriram que diferentes subtipos desses neurônios, mesmo quando localizados na mesma pequena área, projetavam-se para diferentes partes do cérebro e formavam conexões em padrões distintos. Esse tipo de mapeamento detalhado ajuda os cientistas a entender como circuitos específicos são construídos e como eles podem funcionar.

A técnica também é versátil o suficiente para lidar com tecido que foi corado após a morte do animal. Os pesquisadores mostraram que poderiam imaginar cérebros de um modelo de camundongo com Alzheimer que foram tratados com um corante para destacar placas amiloides, os aglomerados de proteína associados à doença. Mesmo que o tecido tivesse que ser quimicamente tratado para se tornar receptivo ao corante, o sistema ainda podia imaginar o céremo inteiro, revelando a distribuição generalizada dessas placas. Isso demonstra que o método não se limita a animais geneticamente modificados, mas pode ser aplicado a uma ampla gama de questões biológicas, desde o estudo do sistema imunológico no baço até o mapeamento da propagação de doenças.

O sucesso do projeto depende fortemente do software, que é gratuito e aberto para qualquer pessoa usar. Os autores enfatizam que, embora o hardware exija habilidade para construir e manter, o software remove a barreira de precisar de um código personalizado para cada nova configuração. Ele permite que uma comunidade de pesquisadores compartilhe designs e melhorias, criando uma forma padronizada de realizar essas tarefas complexas de imagem. O sistema não é perfeito; ele não consegue imaginar o cérebro de um animal muito maior, como um furão, porque a cobertura externa dura do cérebro é difícil demais para cortar, e não foi projetado para a ampliação extrema necessária para rastrear um único axônio até o seu ramo mais fino. No entanto, para a vasta maioria das questões neurocientíficas que exigem uma visão de todo o cérebro, ele oferece um caminho rápido, confiável e acessível. Ao transformar um processo complexo e destrutivo em um fluxo de trabalho simplificado e automatizado, o BrainSaw e o BakingTray tornaram possível para mais cientistas explorarem o cérebro em três dimensões, transformando a tarefa impossível de mapear o órgão inteiro em uma parte rotineira da pesquisa moderna.