High-throughput serial two-photon tomography with BakingTray and BrainSaw

Para entender el cerebro, los científicos deben verlo en tres dimensiones. El cerebro no es un mapa plano, sino un bosque denso y enmarañado de conexiones que se extiende a través de un volumen de tejido. Durante décadas, los investigadores han luchado por capturar este volumen completo sin destruir las mismísimas relaciones que buscan estudiar. Los métodos tradicionales suelen consistir en rebanar el cerebro en finas láminas, montarlas en portaobjetos de vidrio e intentar reensamblar el rompecabezas más tarde. Este proceso está plagado de problemas: las delicadas rebanadas pueden rasgarse, deformarse o perderse, rompiendo la historia continua de cómo una parte del cerebro se conecta con otra. Aunque existen otras técnicas para hacer que el tejido sea transparente e imaginarlo íntegro, a menudo requieren tratamientos químicos complejos que tardan semanas y exigen equipos especializados. Existe la necesidad de un método que sea rápido, fiable y capaz de manejar muchas muestras a la vez, permitiendo a los científicos mapear la arquitectura del cerebro con alta precisión mientras mantienen el tejido intacto durante el proceso de imagen.

Un equipo de investigadores ha desarrollado una solución que combina una potente técnica de imagen con una nueva plataforma de software de código abierto para hacer esto posible. Llaman a su sistema "BrainSaw", un nombre que refleja su función: rebana e imagina el cerebro simultáneamente. La tecnología central se basa en un microscopio de dos fotones, que utiliza un haz de luz enfocado para ver en la profundidad del tejido, junto con un vibrátomo, un dispositivo que corta finas rebanadas de tejido. En lugar de retirar las rebanadas, el sistema captura la imagen de la superficie fresca y expuesta del bloque después de cada corte. A medida que el microscopio captura la imagen de la superficie, la máquina rebana esa capa, revelando una nueva superficie debajo, y el proceso se repite miles de veces. Esto crea una película tridimensional fluida de todo el órgano. La innovación en este trabajo no es solo el hardware, sino el software que lo controla, llamado BakingTray. Este software actúa como el director de orquesta, indicando al microscopio cuándo escanear, cuándo cortar y cómo ensamblar los millones de imágenes en un único conjunto de datos 3D utilizable.

Los investigadores construyeron doce de estos sistemas alrededor del mundo, comenzando en 2016, y los han puesto a trabajar en una instalación concurrida en el Centro Sainsbury Wellell Centre en Londres. A lo largo de los años, estas máquinas han procesado más de 7,000 muestras, contribuyendo a docenas de artículos científicos. El sistema está diseñado para ser lo suficientemente robusto como para funcionar sin supervisión durante horas, a menudo durante la noche, permitiendo a los investigadores procesar múltiples cerebros en una sola sesión. El software es lo suficientemente flexible como para manejar diferentes tipos de microscopios y configuraciones de hardware, lo que significa que los laboratorios pueden construir sus propios sistemas o convertir microscopios existentes en estos dispositivos de alto rendimiento. El equipo demostró que el sistema es fiable, ya que la gran mayoría de las sesiones de imagen se completan sin necesidad de reiniciar. Cuando ocurren interrupciones, suelen deberse a errores de usuario simples o contratiempos técnicos previsibles, y el sistema está diseñado para reanudarse rápidamente, a menudo en menos de una hora.

El poder de este enfoque se ve mejor en lo que permite hacer a los científicos. Una aplicación importante es localizar la trayectoria precisa de un electrodo que fue insertado en el cerebro de un animal vivo para registrar la actividad. Al sumergir el electrodo en un tinte fluorescente antes de la inserción, la trayectoria que deja tras de sí brilla bajo el microscopio. El BrainSaw puede imaginar el cerebro completo, trazar el tinte y mapear la ubicación exacta del sitio de registro en tres dimensiones, eliminando las conjeturas sobre de dónde procedían los datos. Otro uso clave es el conteo de células. El sistema puede imaginar un cerebro completo con una resolución lo suficientemente fina como para ver cuerpos celulares individuales, y un software automatizado puede entonces contar cada neurona etiquetada en todo el órgano. Esto permite a los investigadores comparar el número de células entre diferentes animales o regiones cerebrales con un nivel de detalle que antes era imposible de lograr a escala.

Más allá del simple conteo y seguimiento, el sistema revela cómo diferentes tipos de células cerebrales se conectan entre sí. En un experimento, los investigadores se dirigieron a neuronas inhibitorias específicas en una pequeña región del cerebro llamada núcleo geniculado lateral ventral. Utilizaron un virus para hacer que estas neuronas brillaran y para marcar sus terminales sinápticos, los diminutos puntos donde se comunican con otras células. Al imaginar el cerebro completo, pudieron ver no solo hacia dónde enviaban sus largos axones las neuronas, sino exactamente dónde formaban conexiones esos axones. Descubrieron que diferentes subtipos de estas neuronas, incluso cuando se encuentran en la misma área pequeña, se proyectan a diferentes partes del cerebro y forman conexiones en patrones distintos. Este tipo de mapeo detallado ayuda a los científicos a comprender cómo se construyen los circuitos específicos y cómo podrían funcionar.

La técnica también es lo suficientemente versátil como para manejar tejido que ha sido teñido después de la muerte del animal. Los investigadores demostraron que podían imaginar cerebros de un modelo de ratón con la enfermedad de Alzheimer que había sido tratado con un tinte para resaltar las placas amiloides, los cúmulos de proteína asociados con la enfermedad. Aunque el tejido tuvo que ser tratado químicamente para hacerlo receptivo al tinte, el sistema pudo seguir imaginando el cerebro completo, revelando la distribución generalizada de estas placas. Esto demuestra que el método no se limita a animales modificados genéticamente, sino que puede aplicarse a una amplia gama de preguntas biológicas, desde el estudio del sistema inmunológico en el bazo hasta el mapeo de la propagación de enfermedades.

El éxito del proyecto depende en gran medida del software, que es gratuito y abierto para que cualquiera lo utilice. Los autores enfatizan que, si bien el hardware requiere habilidad para construirlo y mantenerlo, el software elimina la barrera de necesitar código personalizado para cada nueva configuración. Permite que una comunidad de investigadores comparta diseños y mejoras, creando una forma estandarizada de realizar estas complejas tareas de imagen. El sistema no es perfecto; no puede imaginar el cerebro de un animal mucho más grande, como un hurón, porque la dura cubierta exterior del cerebro es demasiado difícil de cortar, y no está diseñado para la magnificación extrema necesaria para rastrear un solo axón hasta su rama más fina. Sin embargo, para la gran mayoría de las preguntas neurocientíficas que requieren una visión de todo el cerebro, ofrece un camino rápido, fiable y accesible. Al convertir un proceso complejo y destructivo en un flujo de trabajo optimizado y automatizado, el BrainSaw y BakingTray han hecho posible que más científicos exploren el cerebro en tres dimensiones, convirtiendo la tarea imposible de mapear el órgano completo en una parte rutinaria de la investigación moderna.