High-throughput serial two-photon tomography with BakingTray and BrainSaw

Um das Gehirn zu verstehen, müssen Wissenschaftler es in drei Dimensionen sehen. Das Gehirn ist keine flache Landkarte, sondern ein dichter, verschlungener Wald aus Verbindungen, der sich durch ein Volumen von Gewebe erstreckt. Jahrzehntelang haben Forscher darum gekämpft, dieses gesamte Volumen zu erfassen, ohne die sehr Beziehungen zu zerstören, die sie eigentlich untersuchen wollen. Traditionelle Methoden beinhalten oft das Zerschneiden des Gehirns in dünne Schichten, das Aufbringen auf Objektträger aus Glas und den Versuch, das Puzzle später wieder zusammenzusetzen. Dieser Prozess ist anfällig für Probleme: Die empfindlichen Schnitte können reißen, sich verformen oder verloren gehen, wodurch die kontinuierliche Geschichte darüber, wie ein Teil des Gehirns mit einem anderen verbunden ist, unterbrochen wird. Während andere Techniken existieren, um Gewebe transparent zu machen und es als Ganzes abzubilden, erfordern sie oft komplexe chemische Behandlungen, die Wochen dauern und spezialisierte Ausrüstung verlangen. Es besteht ein Bedarf an einer Methode, die schnell, zuverlässig und in der Lage ist, viele Proben gleichzeitig zu bearbeiten, um die Architektur des Gehirns mit hoher Präzision abzubilden und gleichzeitig das Gewebe während des Bildgebungsprozesses intakt zu halten.

Ein Team von Forschern hat eine Lösung entwickelt, die eine leistungsstarke Bildgebungstechnik mit einer neuen, Open-Source-Softwareplattform kombiniert, um dies möglich zu machen. Sie nennen ihr System „BrainSaw“, ein Name, der seine Funktion widerspiegelt: Es schneidet und bildet das Gehirn gleichzeitig ab. Die Kerntechnologie basiert auf einem Zwei-Photonen-Mikroskop, das einen fokussierten Lichtstrahl nutzt, um tief in das Gewebe zu blicken, gepaart mit einem Vibratom, einem Gerät, das dünne Gewebeschnitte schneidet. Anstatt die Schnitte zu entfernen, bildet das System die frische, freigelegte Oberfläche des Blocks nach jedem Schnitt ab. Während das Mikroskop das Bild der Oberfläche aufnimmt, schneidet die Maschine diese Schicht ab, legt eine neue Oberfläche darunter frei, und der Prozess wiederholt sich tausende Male. Dies erzeugt einen nahtlosen, dreidimensionalen Film des gesamten Organs. Die Innovation dieser Arbeit liegt nicht nur in der Hardware, sondern in der Software, die sie steuert, genannt „BakingTray“. Diese Software fungt als Dirigent, der dem Mikroskop sagt, wann es scannen soll, wann es schneiden soll und wie es die Millionen von Bildern zu einem einzigen, nutzbaren 3D-Datensatz zusammenfügen soll.

Die Forscher haben weltweit zwölf dieser Systeme gebaut, beginnend im Jahr 2016, und haben sie in einer geschäftigen Einrichtung am Sainsbury Wellcome Centre in London eingesetzt. Im Laufe der Jahre haben diese Maschinen mehr als 7.000 Proben abgebildet und damit zu Dutzenden von wissenschaftlichen Veröffentlichungen beigetragen. Das System ist so robust konzipiert, dass es stundenlang unbeaufsichtigt laufen kann, oft über Nacht, sodass Forscher mehrere Gehirne in einer einzigen Sitzung bearbeiten können. Die Software ist flexibel genug, um verschiedene Arten von Mikroskopen und Hardware-Setups zu handhaben, was bedeutet, dass Labore ihre eigenen Systeme bauen oder bestehende Mikroskope in diese Hochdurchsatz-Bildgeber umwandeln können. Das Team hat demonstriert, dass das System zuverlässig ist, wobei die überwiegende Mehrheit der Bildgebungssitzungen ohne einen Neustart abgeschlossen wurde. Wenn Unterbrechungen auftreten, sind sie meist auf einfache Benutzerfehler oder vorhersehbare technische Probleme zurückzuführen, und das System ist so konzipiert, dass es schnell wieder aufnehmen kann, oft innerhalb einer Stunde.

Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes zeigt sich am besten in dem, was er Wissenschaftlern ermöglicht. Eine wichtige Anwendung ist das Lokalisieren des präzisen Pfades einer Elektrode, die in das Gehirn eines lebenden Tieres eingeführt wurde, um Aktivitäten aufzuzeichnen. Indem man die Elektrode vor dem Einsetzen in einen Fluoreszenzfarbstoff taucht, leuchtet die Spur, die sie hinterlässt, unter dem Mikroskop auf. Der BrainSaw kann das gesamte Gehirn abbilden, den Farbstoff verfolgen und den exakten Ort der Aufzeichnung in drei Dimensionen kartieren, wodurch das Raten darüber, woher die Daten stammen, eliminiert wird. Ein weiterer wichtiger Einsatz ist das Zählen von Zellen. Das System kann ein ganzes Gehirn mit einer Auflösung abbilden, die fein genug ist, um einzelne Zellkörper zu sehen, und eine automatisierte Software kann dann jeden markierten Neuronen im gesamten Organ zählen. Dies ermöglicht es Forschern, Zellzahlen über verschiedene Tiere oder Hirnregionen hinweg mit einem Detailgrad zu vergleichen, der zuvor in diesem Umfang nicht erreichbar war.

Über das einfache Zählen und Verfolgen hinaus offenbart das System, wie verschiedene Arten von Gehirnzellen miteinander verbunden sind. In einem Experiment zielten die Forscher auf spezifische inhibitorische Neuronen in einem kleinen Bereich des Gehirns namens ventraler lateraler Geniculatus Nucleus ab. Sie verwendeten ein Virus, um diese Neuronen zum Leuchten zu bringen und ihre synaptischen Endigungen, die winzigen Punkte, an denen sie mit anderen Zellen kommunizieren, zu markieren. Durch die Abbildung des gesamten Gehirns konnten sie nicht nur sehen, wohin diese Neuronen ihre langen Axone senden, sondern auch genau, wo diese Axone Verbindungen aufbauen. Sie fanden heraus, dass verschiedene Subtypen dieser Neuronen, selbst wenn sie sich im selben kleinen Bereich befinden, in unterschiedliche Teile des Gehirns projizieren und Verbindungen in unterschiedlichen Mustern bilden. Diese Art der detaillierten Kartierung hilft Wissenschaftlern zu verstehen, wie spezifische Schaltkreise aufgebaut sind und wie sie funktionieren könnten.

Die Technik ist auch vielseitig genug, um Gewebe zu handhaben, das nach dem Tod des Tieres gefärbt wurde. Die Forscher zeigten, dass sie Gehirne eines Mausmodells für die Alzheimer-Krankheit abbilden konnten, die mit einem Farbstoff behandelt worden waren, um Amyloid-Plaques – die mit der Krankheit assoziierten Proteinansammlungen – hervorzuheben. Obwohl das Gewebe chemisch behandelt werden musste, um für den Farbstoff empfänglich zu sein, konnte das System dennoch das gesamte Gehirn abbilden und die weit verbreitete Verteilung dieser Plaques aufzeigen. Dies demonstriert, dass die Methode nicht auf genetisch veränderte Tiere beschränkt ist, sondern auf eine breite Palette biologischer Fragen angewendet werden kann, vom Studium des Immunsystems in der Milz bis hin zur Kartierung der Ausbreitung von Krankheiten.

Der Erfolg des Projekts beruht maßgeblich auf der Software, die kostenlos und offen für jeden zur Nutzung bereitsteht. Die Autoren betonen, dass die Hardware zwar Geschick beim Bau und der Wartung erfordert, die Software jedoch die Barriere beseitigt, für jedes neue Setup einen individuellen Code benötigen zu müssen. Sie ermöglicht es einer Gemeinschaft von Forschern, Designs und Verbesserungen zu teilen, wodurch ein Standard für die Durchführung dieser komplexen Bildgebungsaufgaben geschaffen wird. Das System ist nicht perfekt; es kann das Gehirn eines viel größeren Tieres wie eines Nerzes nicht abbilden, da die harte äußere Hülle des Gehirns zu schwierig zu schneiden ist, und es ist nicht für die extreme Vergrößerung ausgelegt, die nötig wäre, um ein einzelnes Axon bis zu seiner feinsten Verzweigung zurückzuverfolgen. Für die überwiegende Mehrheit der neurowissenschaftlichen Fragen, die eine Sicht auf das gesamte Gehirn erfordern, bietet es jedoch einen schnellen, zuverlässigen und zugänglichen Weg nach vorne. Indem es einen komplexen, destruktiven Prozess in einen gestrafften, automatisierten Arbeitsablauf verwandelt, haben BrainSaw und BakingTray es Wissenschaftlern ermöglicht, das Gehirn in drei Dimensionen zu erforschen, und die einst unmögliche Aufgabe, das gesamte Organ zu kartieren, zu einem Routinebestandteil moderner Forschung gemacht.