High-throughput serial two-photon tomography with BakingTray and BrainSaw

为了理解大脑，科学家必须从三维角度观察它。大脑不是一张平面的地图，而是一个穿梭在组织体积中的、由连接构成的密集且纠缠不清的森林。几十年来，研究人员一直致力于捕捉这种完整的体积，却又难以避免破坏他们试图研究的那些关系。传统方法通常涉及将大脑切成薄片，将其安装在玻璃载玻片上，然后尝试在稍后重新组装这个拼图。这个过程充满了问题：脆弱的切片可能会撕裂、变形或丢失，从而破坏一个大脑部分如何连接到另一个部分的连续性故事。虽然存在其他使组织透明并进行整体成像的技术，但它们通常需要耗时数周且需要专门设备的复杂化学处理。因此，需要一种快速、可靠且能够同时处理多个样本的方法，以便科学家能在保持组织完整的同时，以高精度绘制大脑的架构。

一个研究团队开发了一种解决方案，将一种强大的成像技术与一个新的开源软件平台相结合，使这一切成为可能。他们将该系统称为“BrainSaw”（大脑锯），这个名字反映了它的功能：它同时对大脑进行切片和成像。其核心技术依赖于双光子显微镜（它利用聚焦光束深入观察组织内部）以及一台振动切片机（一种切割薄组织片的设备）。该系统并非移除切片，而是在每次切割后对新鲜、暴露的组织块表面进行成像。随着显微镜捕捉表面图像，机器会切掉那一层，露出下方的全新表面，这一过程重复数千次。这创造了一部整个器官的无缝三维电影。这项工作的创新不仅在于硬件，还在于控制它的软件，名为“BakingTray”。该软件充当指挥家，指挥显微镜何时扫描、何时切割，以及如何将数百万张图像拼接成一个单一的、可使用的三维数据集。

研究人员从2016年开始在全球范围内构建了十二套这样的系统，并将它们投入到伦敦赛恩斯伯里·威尔科姆中心（Sainsbury Well下来 Centre）的一个繁忙设施中投入使用。多年来，这些机器已经成像了超过7,000个样本，为数十篇科学论文做出了贡献。该系统设计得足够稳健，可以无人值守运行数小时（通常是整夜），从而允许研究人员在单次实验中处理多个大脑。该软件具有足够的灵活性，可以处理不同类型的显微镜和硬件设置，这意味着实验室可以构建自己的系统，或者将现有的显微镜转换为这些高通量成像仪。团队证明了该系统的可靠性，绝大多数成像过程都在无需重启的情况下完成。即使发生中断，通常也是由于简单的用户错误或可预见的各种技术故障，且系统设计为可以快速恢复，通常在一小时内即可恢复。

这种方法的强大之处在于它能让科学家实现什么。一个主要的应用程序是定位插入活体动物大脑以记录活动的电极的精确路径。通过在插入电极前将其浸入荧光染料，电极留下的痕迹会在显微镜下发光。BrainSaw可以对整个大脑进行成像，追踪染料，并在三维空间中绘制出记录位点的精确位置，消除了对数据来源地的猜测。另一个关键用途是计数细胞。该系统可以对整个大脑进行成像，其分辨率足以看到单个细胞体，随后自动化软件可以统计整个器官中每一个标记的神经元。这使得研究人员能够在大规模研究中，以以往无法实现的细节水平来比较不同动物或脑区之间的细胞数量。

除了简单的计数和追踪，该系统还能揭示不同类型的脑细胞是如何相互连接的。在一次实验中，研究人员针对被称为腹外侧膝状体（ventral lateral geniculate nucleus）的小区域内的特定抑制性神经元进行了研究。他们使用一种病毒使这些神经元发光，并标记它们的突触末梢（即它们与其他细胞进行通信的微小点）。通过对整个大脑进行成像，他们不仅可以看到这些神经元的长轴突在哪里延伸，还能准确看到这些轴突在哪里形成了连接。他们发现，即使位于同一个微小区域，不同亚型的这些神经元也会投射到大脑的不同部分，并形成截然不同的连接模式。这种详细的绘图有助于科学家理解特定的电路是如何构建的，以及它们可能如何运作。

该技术也足够多样化，可以处理在动物死亡后进行染色的组织。研究人员展示了他们可以对患有阿尔茨海默病的小鼠模型的大脑进行成像，这些大脑经过了突出显示淀粉样蛋白斑块（与该疾病相关的蛋白质团块）的染色处理。尽管组织必须经过化学处理才能对染色产生反应，但该系统仍能对整个大脑进行成像，揭示这些斑块的广泛分布。这表明该方法并不局限于基因改造动物，还可以应用于广泛的生物学问题，从研究脾脏中的免疫系统到绘制疾病的扩散路径。

该项目的成功很大程度上依赖于其免费且向所有人开放的软件。作者强调，虽然硬件需要技巧来构建和维护，但软件消除了为每个新设置编写自定义代码的障碍。它允许研究社区分享设计和改进方案，从而建立起执行这些复杂成像任务的标准方式。该系统并不完美：它无法对像雪貂这样的大型动物的大脑进行成像，因为大脑坚硬的外层难以切割；而且它也不是为了追踪单个轴突直至其最细微分支所需的极端放大倍率而设计的。然而，对于绝大多数需要全脑视野的神经科学问题而言，它提供了一条快速、可靠且易于获取的前进道路。通过将一个复杂的、破坏性的过程转变为流线型的、自动化的工作流，BrainSaw和BakingTray使得更多科学家能够探索三维大脑，将绘制整个器官这一不可能的任务变成了现代研究的常规部分。