High-throughput serial two-photon tomography with BakingTray and BrainSaw

Om de hersenen te begrijpen, moeten wetenschappers ze in drie dimensies zien. De hersenen zijn geen platte kaart, maar een dicht, verstrengeld bos van verbindingen dat zich uitstrekt door een volume aan weefsel. Decennialang hebben onderzoekers geprobeerd dit volledige volume vast te leggen zonder de zeer relaties te vernietigen die zij juist willen bestudelen. Traditionele methoden houden vaak in dat de hersenen in dunne vellen worden gesneden, op glazen objectdragers worden gemonteerd en dat men later probeert de puzzel weer in elkaar te zetten. Dit proces is problematisch: de delicate plakjes kunnen scheuren, vervormen of verloren gaan, waardoor het doorlopende verhaal van hoe het ene deel van de hersenen met het andere verbonden is, wordt doorbroken. Hoewel er andere technieken bestaan om weefsel transparant te maken en het als geheel te beeldvormen, vereisen deze vaak complexe chemische behandelingen die weken duren en gespecialiseerde apparatuur vereisen. Er is behoefte aan een methode die snel, betrouwbaar en in staat is om veel monsters tegelijk te verwerken, zodat wetenschappers de architectuur van de hersenen met hoge precisie in kaart kunnen brengen terwijl het weefsel tijdens het beeldvormingsproces intact blijft.

Een team van onderzoekers heeft een oplossing ontwikkeld die een krachtige beeldvormingstechniek combineert met een nieuw, open-source softwareplatform om dit mogelijk te maken. Ze noemen hun systeem een "BrainSaw", een naam die naar zijn functie verwijst: het snijdt en beeldt de hersenen gelijktijdig af. De kerntechnologie steunt op een tweefotonmicroscoop, die een gefocuste lichtstraal gebruikt om diep in het weefsel te kijken, gekoppeld aan een vibratoom, een apparaat dat dunne plakjes weefsel snijdt. In plaats van de plakjes te verwijderen, beeldt het systeem het verse, blootgestelde oppervlak van het blok af na elke snede. Terwijl de microscoop de afbeelding van het oppervlak vastlegt, snijdt de machine die laag eraf, waardoor een nieuw oppervlak eronder wordt onthuld, en het proces herhaalt zich duizenden keren. Dit creëert een naadloze, driedimensionale film van het gehele orgaan. De innovatie in dit werk is niet alleen de hardware, maar ook de software die het aanstuurt, genaamd BakingTray. Deze software fungeert als de dirigent, die de microscoop vertelt wanneer hij moet scannen, wanneer hij moet snijden en hoe hij de miljoen afbeeldingen aan elkaar moet naaien tot een enkele, bruikbare 3D-dataset.

De onderzoekers hebben twaalf van deze systemen gebouwd over de hele wereld, beginnend in 2016, en hebben ze aan het werk gezet in een drukke faciliteit bij het Sainsbury Wellcome Centre in Londen. In de loop der jaren hebben deze machines meer dan 7.000 monsters geïmageerd, wat heeft bijgedragen aan tientallen wetenschappelijke artikelen. Het systeem is ontworpen om robuust genoeg te zijn om urenlang, vaak zelfs de hele nacht, onbeheerd te draaien, waardoor onderzoekers meerdere hersenen in één sessie kunnen verwerken. De software is flexibel genoeg om verschillende soorten microscopen en hardware-opstellingen te verwerken, wat betekent dat laboratoria hun eigen systemen kunnen bouwen of bestaande microscopen kunnen omzetten in deze hoog-doorvoersystemen. Het team heeft aangetoond dat het systeem betrouwbaar is, waarbij het overgrote deel van de beeldvormingssessies voltooid wordt zonder dat een herstart nodig is. Wanneer onderbrekingen optreden, zijn deze meestal te wijten aan eenvoudige gebruikersfouten of voorspelbare technische haperingen, en het systeem is ontworpen om snel te hervatten, vaak binnen een uur.

De kracht van deze aanpak blijkt het beste uit wat het wetenschappers mogelijk maakt. Een belangrijke toepassing is het lokaliseren van het precieze pad van een elektrode die in de hersenen van een levend dier is ingebracht om activiteit te registreren. Door de elektrode voor insertie in een fluorescerende kleurstof te dompelen, geeft het spoor dat het achterlaat een gloed onder de microscoop. De BrainSaw kan de gehele hersenen beeldvormen, het kleurstofspoor volgen en de exacte locatie van de registratieplaats in drie dimensies in kaart brengen, waardoor de giswerkzaamheid over waar de data vandaan kwam, wordt weggenomen. Een ander belangrijk gebruik is het tellen van cellen. Het systeem kan een hele hersenstructuur beeldvormen met een resolutie die fijn genoeg is om individuele cellichamen te zien, waarna geautomatiseerde software vervolgens elk gelabeld neuron in het gehele orgaan kan tellen. Dit stelt onderzoekers in staat om celnummers te vergelijken tussen verschillende dieren of hersengebieden met een detailniveau dat voorheen op grote schaal onmogelijk te bereiken was.

Buiten het eenvoudige tellen en volgen, onthult het systeem hoe verschillende typen hersencellen met elkaar verbonden zijn. In één experiment richtten de onderzoekers zich op specifieke inhibitoire neuronen in een klein gebied van de hersenen genaamd de ventrale laterale geniculate nucleus. Ze gebruikten een virus om deze neuronen te laten oplichten en om hun synaptische terminals te markeren, de minuscule punten waar ze communiceren met andere cellen. Door de gehele hersenen te beeldvormen, konden ze niet alleen zien waar de neuronen hun lange axonen heen stuurden, maar ook precies waar die axonen verbindingen vormden. Ze ontdekten dat verschillende subtypes van deze neuronen, zelfs wanneer ze zich in hetzelfde kleine gebied bevinden, naar verschillende delen van de hersenen projecteren en verbindingen vormen in afzonderlijke patronen. Dit soort gedetailleerde mapping helpt wetenschappers te begrijpen hoe specifieke circuits zijn opgebouwd en hoe ze zouden kunnen functioneren.

De techniek is ook veelzijdig genoeg om weefsel te verwerken dat is gekleurd nadat het dier is gestorven. De onderzoekers lieten zien dat ze hersenen konden beeldvormen van een muismodel voor de ziekte van Alzheimer die behandeld waren met een kleurstof om amyloïde plaques te benadrukken, de eiwitklonters die geassocieerd worden met de ziekte. Hoewel het weefsel chemisch behandeld moest worden om ontvankelijk te zijn voor de kleurstof, kon het systeem nog steeds de gehele hersenen beeldvormen, waardoor de wijdverspreide distributie van deze plaques zichtbaar werd. Dit demonstreert dat de methode niet beperkt is tot genetisch gemodificeerde dieren, maar kan worden toegepast op een breed scala aan biologische vragen, van het bestuderen van het immuunsysteem in de milt tot het in kaart brengen van de verspreiding van ziekten.

Het succes van het project rust zwaar op de software, die gratis en openbaar beschikbaar is voor iedereen om te gebruiken. De auteurs benadrukken dat hoewel de hardware vaardigheid vereist om te bouwen en te onderhouden, de software de barrière wegneemt van het nodig hebben van aangepaste code voor elke nieuwe opstelling. Het stelt een gemeenschap van onderzoekers in staat om ontwerpen en verbeteringen te delen, waardoor een standaardmethode ontstaat voor het uitvoeren van deze complexe beeldvormingstaken. Het systeem is niet perfect; het kan de hersenen van een veel groter dier, zoals een ferret, niet beeldvormen omdat de harde buitenkant van de hersenen te moeilijk te snijden is, en het is niet ontworpen voor de extreme vergroting die nodig is om een enkele axon tot in zijn fijnste vertakking te volgen. Echter, voor het overgrote deel van de neurowetenschappelijke vragen die een overzicht van de gehele hersenen vereisen, biedt het een snelle, betrouwbare en toegankelijke weg vooruit. Door een complex, destructief proces te veranderen in een gestroomlijnde, geautomatiseerde workflow, hebben de BrainSaw en BakingTray het mogelijk gemaakt voor meer wetenschappers om de hersenen in drie dimensies te verkennen, waardoor de onmogelijke taak van het in kaart brengen van het gehele orgaan een routineonderdeel van modern onderzoek is geworden.