High-throughput serial two-photon tomography with BakingTray and BrainSaw

뇌를 이해하기 위해 과학자들은 뇌를 3차원으로 보아야 합니다. 뇌는 평면적인 지도가 아니라 조직의 부피를 가로질러 뻗어 있는 밀도 높고 뒤엉킨 연결의 숲입니다. 수십 년 동안 연구자들은 연구하고자 하는 바로 그 관계들을 파괴하지 않고 이 전체 부피를 포착하기 위해 고군분투해 왔습니다. 전통적인 방법은 종종 뇌를 얇은 시트로 자르고 이를 유리 슬라이드에 부착한 다음 나중에 퍼즐을 재조립하려고 시도하는 과정을 포함합니다. 이 과정은 문제가 많습니다. 섬세한 조각들이 찢어지거나, 뒤틀리거나, 분실되어 한 부분이 다른 부분과 어떻게 연결되는지에 대한 연속적인 이야기를 끊어버릴 수 있기 때문입니다. 조직을 투명하게 만들어 전체를 촬영할 수 있는 다른 기술들도 존재하지만, 이들은 종-종 몇 주가 걸리는 복잡한 화학적 처리를 필요로 하며 전문 장비를 요구합니다. 빠르고 신뢰할 수 있으며 동시에 많은 샘플을 처리할 수 있는, 즉 조직을 온전하게 유지하면서도 높은 정밀도로 뇌의 구조를 지도화할 수 있는 방법이 필요합니다.

연구팀은 이를 가능하게 하기 위해 강력한 이미징 기술과 새로운 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼을 결합한 솔루션을 개발했습니다. 그들은 이 시스템을 "브레인소(BrainSaw)"라고 부르는데, 이는 그 기능, 즉 뇌를 자름과 동시에 촬영한다는 점을 반영한 이름입니다. 핵심 기술은 조직 내부 깊숙이 빛을 쏘아 볼 수 있는 이광자 현미경(two-photon microscope)과 조직을 얇게 자르는 장치인 진동 절편기(vibratome)를 결합한 것입니다. 이 시스템은 조각을 제거하는 대신, 매번 절단된 후의 신선하고 노출된 표면을 촬영합니다. 현미경이 표면의 이미지를 캡처하면 기계가 그 층을 잘라내어 그 아래의 새로운 표면을 드러내고, 이 과정이 수천 번 반복됩니다. 이는 전체 기관의 끊김 없는 3차원 영화를 만들어냅니다. 이 작업의 혁신은 하드웨어뿐만 아니라 이를 제어하는 '베이킹트레이(BakingTray)'라는 소프트웨어에 있습니다. 이 소프트웨어는 지휘자 역할을 하여 현미경이 언제 스캔할지, 언제 자를지, 그리고 수백만 개의 이미지를 어떻게 하나의 사용 가능한 3D 데이터 세트로 엮을지를 결정합니다.

연구진은 2016년부터 전 세계에 12개의 이러한 시스템을 구축했으며, 런던의 세인즈버리 웰컴 센터(Sainsbury Well Well Centre)의 바쁜 시설에서 이를 활용해 왔습니다. 수년간 이 기계들은 7,000개 이상의 샘플을 촬영하며 수십 편의 과학 논문에 기여했습니다. 이 시스템은 몇 시간 동안, 종종 밤새도록 사람 없이 작동할 수 있을 만큼 견고하게 설계되어 있어, 연구자들이 한 번의 세션 동안 여러 개의 뇌를 처리할 수 있게 해줍니다. 소프트웨어는 다양한 유형의 현미경과 하드웨어 설정을 처리할 수 있을 만큼 유연하여, 실험실에서 자체적인 시스템을 구축하거나 기존 현미경을 이러한 고처리량 이미징 장치로 전환할 수 있습니다. 연구팀은 시스템이 매우 안정적이어서 대다수의 이미징 세션이 재시작 없이 완료된다는 것을 입증했습니다. 중단이 발생하는 경우, 대개 단순한 사용자 오류나 예측 가능한 기술적 문제 때문이며, 시스템은 빠르게 재개할 수 있도록 설계되어 있어 종종 1시간 이내에 복구됩니다.

이 접근 방식의 힘은 과학자들이 무엇을 할 수 있게 해주는지를 통해 가장 잘 드러납 있습니다. 한 가지 주요 응용 분야는 살아있는 동물의 뇌에 삽입된 전극의 정확한 경로를 찾는 것입니다. 전극을 삽입하기 전 형광 염료에 담가두면, 전극이 남긴 흔적이 현미경 아래에서 빛을 발합니다. 브레인소는 뇌 전체를 촬영하여 염료의 궤적을 추적하고, 기록 지점의 정확한 위치를 3차원으로 지도화함으로써 데이터가 어디에서 왔는지에 대한 추측을 제거합니다. 또 다른 핵심 용도는 세포 수를 세는 것입니다. 이 시스템은 개별 세포체를 볼 수 있을 만큼 미세한 해상도로 뇌 전체를 촬영할 수 있으며, 자동화된 소프트웨는 전체 기관 내의 모든 표지된 뉴런을 셀 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 이전에는 대규모로 달성하기 불가능했던 수준의 세부 정보를 바탕으로 서로 다른 동물이나 뇌 영역 간의 세포 수를 비교할 수 있습니다.

단순한 계수와 추적을 넘어, 이 시스템은 서로 다른 유형의 뇌 세포들이 어떻게 연결되는지를 밝혀냅니다. 한 실험에서 연구진은 뇌의 작은 영역인 복측 외측 무릎핵(ventral lateral geniculate nucleus)에 있는 특정 억제성 뉴런을 표적으로 삼았습니다. 그들은 바이러스를 사용하여 이 뉴런들을 빛나게 만들고, 이들이 다른 세포와 통신하는 작은 지점인 시냅스 말단을 표시했습니다. 뇌 전체를 촬영함으로써, 그들은 뉴런이 긴 축삭(axon)을 어디로 보내는지뿐만 아니라, 그 축삭이 정확히 어디에서 연결을 형성하는지까지 볼 수 있었습니다. 그들은 동일한 작은 구역에 위치하더라도 이 뉴런들의 서로 다른 아형(subtype)들이 뇌의 서로 다른 부분으로 투사되며 독특한 패턴으로 연결을 형성한다는 것을 발견했습니다. 이러한 상세한 매핑은 과학자들이 특정 회로가 어떻게 구축되고 어떻게 기능할 수 있는지를 이해하는 데 도움을 줍니다.

이 기술은 동물이 죽은 후에 염색된 조직도 처리할 수 있을 만큼 다재다능합니다. 연구진은 알츠하이머병 마우스 모델의 뇌를 아밀로이드 플라크(질병과 관련된 단백질 덩어리)를 강조하는 염료로 처리한 후 이를 촬영할 수 있음을 보여주었습니다. 조직이 염색에 반응하도록 화학적 처리를 거쳐야 했음에도 불구하고, 시스템은 여로 뇌 전체를 촬영하여 이러한 플라크의 광범위한 분포를 드러냈습니다. 이는 이 방법이 유전자 변형 동물에 국한되지 않고, 비장 내 면역 체계 연구부터 질병의 확산 매핑에 이르기까지 광범위한 생물학적 질문에 적용될 수 있음을 입증합니다.

이 프로젝트의 성공은 누구나 사용할 수 있도록 무료로 공개된 소프트웨어에 크게 의존합니다. 저자들은 하드웨어 구축과 유지 관리에 기술이 필요하지만, 소프트웨어는 새로운 설정마다 맞춤형 코드를 작성해야 하는 장벽을 제거한다고 강조합니다. 이는 연구 커뮤니티가 설계와 개선 사항을 공유하여 이러한 복잡한 이미징 작업을 수행하는 표준적인 방법을 만들 수 있게 합니다. 시스템이 완벽한 것은 아닙니다. 뇌의 딱딱한 외피를 자르기가 너무 어렵기 때문에 페럿과 같은 훨씬 큰 동물의 뇌는 촬영할 수 없으며, 단일 축삭을 가장 미세한 가지까지 추적하는 데 필요한 극도의 배율을 위해 설계된 것도 아닙니다. 그러나 뇌 전체에 대한 시야를 필요로 하는 대다수의 신경과학적 질문에 대해, 이 시스템은 빠르고 신뢰할 수 있으며 접근 가능한 길을 제시합니다. 복잡하고 파괴적인 과정을 효율적이고 자동화된 워크플로우로 바꿈으로써, 브레인소와 베이킹트레이는 더 많은 과학자가 3차원으로 뇌를 탐구할 수 있게 했으며, 전체 기관을 지도화하는 불가능한 과업을 현대 연구의 일상적인 부분으로 바꾸어 놓았습니다.