Identification and Functional Characterisation of a Novel ASAH1 Gene Variant in Two Unrelated Indian Individuals with Childhood-Onset Spinal Muscular Atrophy

तकनीकी सारांश: दो असंबंधित भारतीय व्यक्तियों में बचपन से शुरू होने वाले स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी के साथ एक नवीन ASAH1 जीन वेरिएंट की पहचान और कार्यात्मक लक्षण वर्णन

समस्या विवरण
ASAH1 जीन में रोगजनक वेरिएंट, जो लाइसोसोमल एंजाइम एसिड सेरामिडेज़ (AC) को कूटबद्ध (encode) करते हैं, ऑटोसोमल रिसेसिव विकारों के एक स्पेक्ट्रम का कारण बनते हैं, जो गंभीर फारबर रोग से लेकर प्रोग्रेसिव मायोक्लोनिक एपिलेप्सी के साथ स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (SMA-PME) तक विस्तृत हैं। सामान्यतः यह माना जाता है कि नैदानिक गंभीरता अवशिष्ट एंजाइमी गतिविधि (residual enzymatic activity) के साथ सह-संबंधित होती है, जहाँ गंभीर कमी (<10%) फारबर रोग की ओर ले जाती है और आंशिक गतिविधि (10–30%) SMA-PME से जुड़ी होती है। हालाँकि, विशिष्ट वेरिएंट और फेनोटाइपिक परिवर्तनशीलता (phenotypic variability) के बीच आणविक तंत्रों को जोड़ने वाला सटीक संबंध, विशेष रूप से उन मामलों में जहाँ जैव-रासायनिक मार्कर अपेक्षित रोगजनकता के साथ पूरी तरह से मेल नहीं खाते हैं, अभी भी अनुसंधान का विषय है। यह अध्ययन दो असंबंधित भारतीय रोगियों में बचपन से शुरू होने वाली न्यूरोमस्कुलर कमजोरी के साथ एक नवीन होमोजिगस मिसेंस वेरिएंट की पहचान और कार्यात्मक लक्षण वर्णन को संबोधित करता है, जिनमें से एक मामला SMA-Pрье (SMA-PME) के लक्षणों को प्रदर्शित करता है और दूसरा शुद्ध SMA फेनोटाइप को।

कार्यप्रणाली (Methodology)
अध्ययन ने क्लिनिकल जेनेटिक्स, बायोकेमिस्ट्री और सेल बायोलॉजी को संयोजित करने वाले एक बहु-विषयक दृष्टिकोण का उपयोग किया:

• जेनेटिक विश्लेषण: प्रभावित व्यक्तियों पर होल-एक्सोम सीक्वेंसिंग (WES) की गई। वेरिएंट को मानक डेटाबेस (gnomాల, ClinVar, आदि) का उपयोग करके फ़िल्टर किया गया और VEP एवं Sentieon जैसे उपकरणों का उपयोग करके एनोटेट किया गया। सेंगर सीक्वेंसिंग द्वारा रोगियों और उनके माता-पिता में उम्मीदवार वेरिएंट की ज़ायगोसिटी (zygosity) की पुष्टि की गई।
• ट्रांसक्रिप्ट विश्लेषण: असामान्य स्प्लिसिंग का आकलन करने के लिए एक रोगी और उसके माता-पिता से प्राप्त एपस्टीन-बार वायरस (EBV)-रूपांतरित लिम्फोब्लास्टॉइड सेल लाइनों से RNA निकाला गया।
• कार्यात्मक परीक्षण (Functional Assays):
  • एंजाइमेटिक गतिविधि: फ्लोरोमेट्रिक परख का उपयोग करके रोगी-व्युत्पन्न ल्यूकोसाइट्स और लिम्फोब्लास्टॉइड कोशिकाओं में एसिड सेरामिडेज़ गतिविधि को मापा गया।
  • सेलुलर मॉडल: वाइल्ड-टाइप (WT) ASAH1 cDNA या रोगी-विशिष्ट c.127T>A (p.Tyr43Asn) वेरिएंट के साथ HEK293T कोशिकाओं और फारबर रोग फाइब्रोब्लास्ट (जिनमें AC गतिविधि का अभाव है) को ट्रांसिएंटली ट्रांसफेक्ट किया गया। एक ज्ञात रोगजनक उत्परिवर्तित (c.428G>C, p.Cys143Ser) का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया।
  • प्रोटीन विश्लेषण: AC प्रोटीन अभिव्यक्ति और प्रीकर्सर क्लीवेज (precursor cleavage) का पता लगाने के लिए वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग किया गया।
  • मेटाबॉलिक विश्लेषण: ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर सेरामाइड और डाइहाइड्रोसेरामाइड स्तरों को LC–MS/MS के माध्यम से मात्रात्मक रूप से निर्धारित किया गया।
• इन सिलिको मॉडलिंग (In Silico Modeling): वेरिएंट का विश्लेषण प्रोटीन संरचना और स्थिरता पर संभावित प्रभावों का आकलन करने के लिए कई भविष्यवाणी एल्गोरिदम (SIFT, PolyPhen-2, REVEL, आदि) और स्ट्रक्चरल मॉडलिंग टूल्स (HOPE) का उपयोग करके किया गया।

मुख्य परिणाम

• वेरिएंट की पहचान: WES ने दोनों असंबंधित रोगियों में ASAH1 जीन के एक्सॉन 3 में एक नवीन होमोजिगस मिसेंस वेरिएंट, c.127T>A (p.Tyr43Asn) की पहचान की। यह वेरिएंट सार्वजनिक डेटाबेस (gnomAD) में अनुपस्थित था और दोनों मामलों में माता-पिता में हेटेरोज़ायगस अवस्था में पाया गया।
• नैदानिक फेनोटाइप (Clinical Phenotypes):
  • केस 1: 12 वर्षीय पुरुष जिसमें बचपन से शुरू हुई प्रॉक्सिमल मसल वीकनेस, टंग फैसिकुलेशन और गोअर साइन (Gower sign) देखा गया, लेकिन कोई दौरे (seizures) या मायोक्लोनस नहीं था (SMA फेनोटाइप)।
  • केस 2: 19 वर्षीय महिला जिसमें समान शुरुआत वाली कमजोरी देखी गई, जिसने बाद में सामान्यीकृत टॉनिक-क्लोनिक सीज़र्स, मायोक्लोनस और डिस्टोनिया विकसित किया (SMA-PME फेनोटाइप)।
• जैव-रासायनिक निष्कर्ष: रोगी की कोशिकाओं ने नियंत्रण की तुलना में कम, लेकिन शून्य नहीं, एसिड सेरामिडेज़ गतिविधि दिखाई, जबकि माता-पिता में मध्यम स्तर देखा गया, जो ऑटोसोमल रिसेसिव वंशानुक्रम के अनुरूप है।
• कार्यात्मक लक्षण वर्णन:
  • स्प्लिसिंग: cDNA विश्लेषण ने पुष्टि की कि वेरिएंट असामान्य mRNA स्प्लिसिंग का कारण नहीं बनता है।
  • प्रोटीन अभिव्यक्ति: वेस्टर्न ब्लॉट ने दिखाया कि p.Tyr43Asn उत्परिवर्तित प्रोटीन व्यक्त होता है और 14 kDa अल्फा सबयूनिट में ऑटोकैटलिटिक क्लीवेज से गुजरता है, जबकि p.Cys143Ser नियंत्रण, जो क्लीव होने में विफल रहा था, ऐसा नहीं करता है।
  • एंजाइमेटिक गतिविधि: रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में डेटा के आधार पर अपेक्षित रोगजनकता के विपरीत, संवर्धित मानव कोशिकाओं में एक्टोपिक एक्सप्रेशन (ectopic expression) के माध्यम से प्राप्त एसिड सेरामिडेज़ गतिविधि वाइल्ड-टाइप cDNA से प्राप्त गतिविधि के समान थी।
  • सेरामाइड स्तर: p.Tyr43Asn को फारबर कोशिकाओं में व्यक्त करने से वाइल्ड-टाइप प्रोटीन के समान ही इंट्रासेल्यूलर सेरामाइड संचय में कमी आई।
• ACMG वर्गीकरण: सेग्रिगेशन डेटा, नियंत्रणों में अनुपस्थिति, दो असंबंधित प्रभावित व्यक्तियों में निरंतर फेनोटाइप की उपस्थिति और इन सिलिको भविष्यवाणियों के आधार पर, इस वेरिएंट को ACMG दिशानिर्देशों (PS4, PM1, PM2_supporting, PP2, PP4) द्वारा रोगजनक (IIIb) के रूप में वर्गीकृत किया गया है।

महत्व और दावे
लेखक भारतीय व्यक्तियों में SMA से SMA-PME के फेनोटाइपिकल स्पेक्ट्रम से जुड़े एक नवीन ASAH1 वेरिएंट (p.Tyr43Asn) की पहचान की रिपोर्ट करते हैं, जो एक संभावित फाउंडर इफेक्ट (founder effect) का सुझाव देता है। यह अध्ययन वेरिएंट की व्याख्या के लिए विविध प्रकार के साक्ष्यों को एकीकृत करने के महत्व को रेखांकित करता है।

महत्वपूर्ण रूप से, यह शोध दावा करता है कि इस विशिष्ट वेरिएंट की रोगजनक प्रक्रिया शास्त्रीय सेरामाइड संचय के मॉडल से भिन्न हो सकती है। हालांकि यह वेरिएंट रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं में कम एंजाइम गतिविधि से जुड़ा है, कार्यात्मक परीक्षणों ने दिखाया कि उत्परिवर्तित cDNA संवर्धित मानव कोशिकाओं में पूर्ण उत्प्रेरक गतिविधि बनाए रखता है और वाइल्ड-टाइप प्रोटीन के समान ही सेरामाइड संचय को ठीक कर सकता है। यह निष्कर्ष बताता है कि इन रोगियों में बीमारी का प्राथमिक तंत्र सरल सेरामाइड संचय से अलग है या इसमें अतिरिक्त तंत्र शामिल हैं जिन्हें उपयोग किए गए इन विट्रो मॉडल द्वारा कैप्चर नहीं किया जा सका है। यह अध्ययन ASAH1-संबंधित विकारों की जटिलता और वेरिएंट की रोगजनकता को पूरी तरह से समझने के लिए विविध साक्ष्यों की रेखाओं को मिलाने की आवश्यकता को रेखांकित करता है।