Identification and Functional Characterisation of a Novel ASAH1 Gene Variant in Two Unrelated Indian Individuals with Childhood-Onset Spinal Muscular Atrophy

技術要約：2名の無関係なインド人患者における小児発症型脊髄性筋萎縮症に関連する新規ASAH1遺伝子変異の同定および機能的特性解析

問題提起
リソソーム酵素である酸セラミダーゼ（AC）をコードするASAH1遺伝子の病原性変異は、重度のファーバー病から進行性ミオクローヌスてんかんを伴う脊髄性筋萎縮症（SMA-PME）に至るまで、一連の常染色体劣性疾患を引き起こす。一般に、臨床的な重症度は残留する酵素活性量と相関すると考えられており、10%未満の深刻な欠損はファーバー病を、10〜30%の部分的な活性はSMA-PMEに関連している。しかし、特定の変異が表現型の多様性にどのように結びついているかに関する正確な分子メカニズム、特に生化学的マーカーが予想される病原性と完全には一致しないケースについては、依然として研究領域となっている。本研究は、小児発症の神経筋疾患（一方はSMA-PMEの特徴を示し、もう一方は純粋なSMA表現型を示す）を呈する、無関係な2名のインド人患者における新規のホモ接合型ミスセンス変異の同定および機能的特性解析を目的とする。

方法論
本研究では、臨床遺伝学、生化学、および細胞生物学を組み合わせた多角的なアプローチを採用した：

• 遺伝学的解析： 影響を受けた2名の個人に対して全エクソーム解析（WES）を実施した。変異は標準的なデータベース（gnomAD、Clinars等）を用いてフィルタリングされ、VEPやSentieonなどのツールを用いてアノテーションされた。サンガーシーケンシングにより、患者および両親における候補変異の接合性を確認した。
• 転写解析： 異常なスプライシングを評価するため、一人の患者およびその両親から得られたエプスタイン・バーウイルス（EBV）変換リンパ芽球細胞株からRNAを抽出した。
• 機能解析：
  • 酵素活性： 患者由来の白血球およびリンパ芽球細胞を用い、蛍光法による酸セラミダーゼ活性を測定した。
  • 細胞モデル： 野生型（WT）ASAH1 cDNAまたは患者特異的なc.127T>A (p.Tyr43Asn) 変異を、HEK293T細胞およびファーバー病線維芽細胞（AC活性を欠く）に一過性にトランスフェクションした。既知の病原性変異（c.428G>C, p.Cys143Ser）を陰性コントロールとして用いた。
  • タンパク質解析： ウェスタンブロッティングを用いて、ACタンパク質の発現および前駆体の切断を検出した。
  • 代謝解析： トランスフェクションされた細胞における細胞内セラミドおよびジヒドロセラミドのレベルを、LC–MS/MSを用いて定量化した。
• イン・シリコ・モデリング： 変異を複数の予測アルゴリズム（SIFT、PolyPhen-2、REVEL等）および構造モデリングツール（HOPE）を用いて解析し、タンパク質の構造および安定性への潜在的な影響を評価した。

主な結果

• 変異の同定： WESにより、2名の無関係な患者において、ASAH1遺伝子のエキソン3における新規のホモ接合型ミスセンス変異、c.127T>A (p.Tyr43Asn) が同定された。この変異は公開データベース（gnomAD）には存在せず、両方のケースにおいて両親がヘテロ接合体であることが確認された。
• 臨床表現型：
  • 症例1： 12歳男性。小児発症の近位筋力低下、舌線維束性収縮、およびゲラー徴候を認めるが、痙攣やミオクローヌスは認められない（SMA表現型）。
  • 症例2： 19歳女性。同様の開始時の筋力低下を認め、後に全般性強直間代発作、ミオクローヌス、およびジストニアを発現した（SMA-PME表現型）。
• 生化学的所見： 患者の細胞は、コントロールと比較して減少しているものの消失はしていない酸セラミダーゼ活性を示した。一方、両親は中間的なレベルを示しており、常染色体劣性遺伝の形式と一致していた。
• 機能的特性解析：
  • スプライシング： cDNA解析により、この変異が異常なmRNAスプライシングを引き起こさないことが確認された。
  • タンパク質発現： ウェスタンブロットの結果、p.Tyr43Asn 変異タンパク質は発現し、14 kDaのαサブユニットへの自己触媒的切断を受けることが示された。これは、切断に失敗したp.Cys143Ser コントロールとは対照的である。
  • 酵素活性： 患者細胞のデータに基づく予想に反して、培養ヒト細胞への当該変異cDNAの異所性発現は、野生型cDNAから得られたものと同様の酸セラミダーゼ活性をもたらした。
  • セラミドレベル： p.Tyr43Asn 変異体のファーバー細胞への発現は、野生型タンパク質と同様の程度で細胞内セラミドの蓄積を減少させることに成功した。
• ACMG分類： 分離解析データ、コントロールにおける不在、一貫した表現型を持つ2名の無関係な罹患者の存在、およびイン・シリコ予測に基づき、この変異はACMGガイドライン（PS4, PM1, PM2_supporting, PP2, PP4）に従って病原性（IIIb）と分類された。

意義および主張
著者らは、インド人におけるSMAからSMA-PMEの表現型スペクトラムに関連する新規のASAH1変異（p.Tyr43Asn）を報告しており、これは創始者効果（founder effect）の可能性を示唆している。本研究は、変異の病原性を理解するために、遺伝学的、酵素学的、および臨床的な証拠を統合することの重要性を強調している。

極めて重要な点として、論文は、この特定の変異の病原性メカニズムが古典的なセラミド蓄積モデルとは異なる可能性があると主張している。この変異は患者由来細胞において減少した酵素活性と関連しているものの、培養ヒト細胞を用いた機能解析では、変異体は触媒活性を保持しており、野生型と同様の程度でセラミド蓄積を補正できることが示された。この知見は、これらの患者における主要な病態メカニズムが、単純なセラミド蓄積とは異なるか、あるいは使用されたin vitroモデルでは捉えきれない追加のメカニズムに関与していることを示唆している。本研究は、ASAH1関連疾患の複雑さと、変異の病原性を完全に理解するために多様な証拠のラインを組み合わせる必要性を浮き彫りにしている。