Identification and Functional Characterisation of a Novel ASAH1 Gene Variant in Two Unrelated Indian Individuals with Childhood-Onset Spinal Muscular Atrophy

Sintesi Tecnica: Identificazione e Caratterizzazione Funzionale di una Nuova Variante del Gene ASAH1 in Due Individui Indiani Non Correlati con Atrofia Muscolare Spinale a Esordio Infantile

Problematica
Le varianti patogene nel gene ASAH1, che codifica per l'enzima lisosomiale ceramidasi acida (AC), causano uno spettro di disturbi autosomici recessivi che vanno dalla malattia di Farber grave alla Atrofia Muscolare Spinale con Epilessia Mioclonica Progressiva (SMA-PME). Si ritiene generalmente che la gravità clinica sia correlata all'attività enzimatica residua, dove una grave carenza (<10%) porta alla malattia di Farber e un'attività parziale (10–30%) è associata alla SMA-PME. Tuttavia, i meccanismi molecolari precisi che collegano specifiche varianti alla variabilità fenotipica, in particolare nei casi in cui i marcatori biochimici non si allineano completamente con la patogenicità attesa, rimangono un'area di indagine. Questo studio affronta l'identificazione e la caratterizzazione funzionale di una nuova variante missenso omozigote in due pazienti indiani non correlati che presentano debolezza neuromuscolare a esordio infantile, con un caso che presenta caratteristiche di SMA-PME e l'altro un fenotipo SMA puro.

Metodologia
Lo studio ha impiegato un approccio multidisciplinare combinando genetica clinica, biochimica e biologia cellulare:

• Analisi Genetica: È stata eseguita l'analisi dell'esoma intero (WES) su due individui affetti. Le varianti sono state filtrate utilizzando database standard (gnomAD, ClinVar, ecc.) e annotate mediante strumenti come VEP e Sentieon. Il sequenziamento Sanger ha confermato la zigosi della variante candidata nei pazienti e nei genitori.
• Analisi del Trascritto: L'RNA è stato estratto da linee cellulari linfoblastoidi trasformate con il virus di Epstein-Barr (EBV) derivate da un paziente e dai suoi genitori per valutare eventuali splicing aberranti.
• Saggi Funzionali:
  • Attività Enzimatica: L'attività della ceramidasi acida è stata misurata in leucociti derivati dai pazienti e in cellule linfoblastoidi utilizzando un saggio fluorometrico.
  • Modelli Cellulari: Cellule HEK293T e fibroblasti con malattia di Farber (privi di attività AC) sono stati trasfettati transitoriamente con cDNA wild-type (WT) di ASAH1 o con la variante specifica del paziente c.127T>A (p.Tyr43Asn). Un mutante noto patogeno (c.428G>C, p.Cys143Ser) è servito come controllo negativo.
  • Analisi Proteica: Il Western blotting è stato utilizzato per rilevare l'espressione della proteina AC e la scissione del precursore.
  • Analisi Metabolica: I livelli intracellulari di ceramide e di diidroceramide sono stati quantificati tramite LC–MS/MS in cellule trasfettate.
• Modellazione In Silico: La variante è stata analizzata mediante molteplici algoritmi di predizione (SIFT, PolyPhen-2, REVEL, ecc.) e strumenti di modellazione strutturale (HOPE) per valutare i potenziali impatti sulla struttura e sulla stabilità della proteina.

Risultati Chiave

• Identificazione della Variante: La WES ha identificato una nuova variante missenso omozigote, c.127T>A (p.Tyr43Asn), nell'esone 3 del gene ASAH1 in entrambi i pazienti non correlati. La variante era assente nei database pubblici (gnomAD) ed è stata confermata in stato eterozigote in entrambi i set di genitori.
• Fenotipi Clinici:
  • Caso 1: Un maschio di 12 anni con debolezza muscolare prossimale a esordio infantile, fascicolazioni della lingua e segno di Gower, ma senza convulsioni o mioclono (fenotipo SMA).
  • Caso 2: Una femmina di 19 anni con debolezza simile all'esordio che successivamente ha sviluppato convulsioni tonico-cloniche generalizzate, mioclono e distonia (fenotipo SMA-PME).
• Risultati Biochimici: Le cellule dei pazienti hanno mostrato un'attività della ceramidasi acida ridotta, ma non nulla, rispetto ai controlli, mentre i genitori esibivano livelli intermedi, coerentemente con l'ereditarietà autosomica recessiva.
• Caratterizzazione Funzionale:
  • Splicing: L'analisi del cDNA ha confermato che la variante non causa uno splicing dell'mRNA aberrante.
  • Espressione Proteica: I Western blot hanno mostrato che la proteina mutante p.Tyr43Asn è espressa e subisce la scissione autocatalitica nella subunità alfa da 14 kDa, a differenza del controllo p.Cys143Ser che non ha subito scissione.
  • Attività Enzimatica: Contrariamente alle aspettative per una variante patogena basate sui dati delle cellule dei pazienti, l'espressione ectopica del cDNA mutante in cellule umane coltivate ha portato a un'attività della ceramidasi acida simile a quella ottenuta con il cDNA wild-type.
  • Livelli di Ceramide: L'espressione della variante p.Tyr43Asn in cellule Farber ha ridotto con successo l'accumulo intracellulare di ceramide alla stessa estensione del WT.
• Classificazione ACMG: Sulla base dei dati di segregazione, dell'assenza nei controlli, della presenza in due individui affetti non correlati con un fenotipo coerente e delle predizioni in silico, la variante è classificata come patogena (IIIb) secondo le linee guida ACMG (PS4, PM1, PM2_supporting, PP2, PP4).

Significato e Rivendicazioni
Gli autori riportano l'identificazione di una nuova variante di ASAH1 (p.Tyr43Asn) associata a uno spettro fenotipico da SMA a SMA-PME in individui indiani, suggerendo un potenziale effetto del fondatore. Lo studio evidenzia l'importanza di integrare prove genetiche, enzimatiche e cliniche per l'interpretazione delle varianti.

Fondamentalmente, l'articolo sostiene che il meccanismo patogeno di questa specifica variante possa differire dal modello classico di accumulo di ceramide. Sebbene la variante sia associata a una ridotta attività enzimatica nelle cellule derivate dai pazienti, i saggi funzionali in cellule uane coltivate hanno dimostrato che la proteina mutante mantiene l'attività catalitica e può correggere l'accumulo di ceramide nella stessa misura del wild-type. Questo reperto suggerisce che il meccanismo primario alla base della malattia in questi pazienti sia distinto dal semplice accumulo di ceramide o coinvolga meccanismi aggiuntivi non catturati dai modelli in vitro utilizzati. Lo studio sottolinea la complessità dei disturbi correlati ad ASAH1 e la necessità di combinare diverse linee di evidenza per comprendere appieno la patogenicità della variante.