Identification and Functional Characterisation of a Novel ASAH1 Gene Variant in Two Unrelated Indian Individuals with Childhood-Onset Spinal Muscular Atrophy

Technische Zusammenfassung: Identifizierung und funktionelle Charakterisierung einer neuen ASAH1-Genvariante bei zwei nicht verwandten Personen aus Indien mit spinaler Muskelatrophie im Kindesalter

Problemstellung
Pathogene Varianten im ASAH1-Gen, das das lysosomale Enzym saure Ceramidase (AC) kodiert, verursachen ein Spektrum autosomal-rezessiver Erkrankungen, die von schwerer Farber-Krankheit bis hin zu spinaler Muskelatrophie mit progressiver myokloner Epilepsie (SMA-PME) reichen. Es wird allgemein angenommen, dass der Schweregrad der klinischen Ausprägung mit der verbleibenden Enzymaktivität korreliert, wobei eine schwere Defizienz (<10 %) zur Farber-Krankheit führt und eine partielle Aktivität (10–30 %) mit SMA-PME assoziiert ist. Die präzisen molekularen Mechanismen, die spezifische Varianten mit der phänotypischen Variabilität verknüpfen – insbesondere in Fällen, in denen die biochemischen Marker nicht vollständig mit der erwarteten Pathogenität übereinstimmen – bleiben jedoch ein Untersuchungsgegenstand. Diese Studie befasst sich mit der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung einer neuen homozygoten Missense-Variante in zwei nicht verwandten indischen Patienten, die eine neuromuskuläre Schwäche im Kindesalter aufweisen, wobei ein Fall Merkmale von SMA-PME zeigt und der andere einen reinen SMA-Phänotyp aufweist.

Methodik
Die Studie verfolgte einen multidisziplinären Ansatz, der klinische Genetik, Biochemie und Zellbiologie kombinierte:

• Genetische Analyse: Es wurde eine Exom-Sequenzierung (WES) an zwei betroffenen Individuen durchgeführt. Die Varianten wurden unter Verwendung von Standarddatenbanken (gnomAD, ClinVar usw.) gefiltert und mit Tools wie VEP und Sentieon annotiert. Die Sanger-Sequenzierung bestätigte die Zygosität der Kandidatenvariante in den Patienten und deren Eltern.
• Transkriptanalyse: RNA wurde aus Epstein-Barr-Virus (EBV)-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien extrahiert, die von einem Patienten und seinen Eltern stammen, um auf aberrantes Spleißen zu prüfen.
• Funktionelle Assays:
  • Enzymaktivität: Die saure Ceramidase-Aktivität wurde in patientenabgeleiteten Leukozyten und lymphoblastoiden Zellen mittels eines fluorometrischen Assays gemessen.
  • Zelluläre Modelle: HEK293T-Zellen und Farber-Krankheits-Fibroblasten (die keine AC-Aktivität aufweisen) wurden transient mit WT-ASAH1-cDNA oder der patientenspezifischen c.127T>A (p.Tyr43Asn)-Variante transfiziert. Eine bekannte pathogene Mutante (c.428G>C, p.Cys143Ser) diente als Negativkontrolle.
  • Proteinanalyse: Western Blotting wurde verwendet, um die AC-Proteinexpression und die Vorläuferspaltung (Precursor Cleavage) nachzuweisen.
  • Metabolische Analyse: Die intrazellulären Ceramid- und Dihydroceramid-Spiegel wurden mittels LC–MS/MS in transfizierten Zellen quantifiziert.
• In-silico-Modellierung: Die Variante wurde mit mehreren Vorhersagealgorithmen (SIFT, PolyPhen-2, REVEL usw.) und Strukturmodellierungswerkzeugen (HOPE) analysiert, um potenzielle Auswirkungen auf die Proteinstruktur und -stabilität zu bewerten.

Wesentliche Ergebnisse

• Identifizierung der Variante: Die WES identifizierte eine neue homozygote Missense-Variante, c.127T>A (p.Tyr43Asn), in Exon 3 des ASAH1-Gens in beiden nicht verwandten Patienten. Die Variante war in öffentlichen Datenbanken (gnomAD) nicht vorhanden und wurde in heterozygoter Form in beiden Elterngenerationen bestätigt.
• Klinische Phänotypen:
  • Fall 1: Ein 12-jähriger Junge mit neuromuskulärer Schwäche der proximalen Muskulatur im Kindesalter, Zungenfascikulationen und Gower-Zeichen, jedoch ohne Anfälle oder Myoklonien (SMA-Phänotyp).
  • Fall 2: Eine 19-jährige Frau mit ähnlicher Onset-Schwäche, die später generalisierte tonisch-klonische Anfälle, Myoklonien und Dystonie entwickelte (SMA-PME-Phänotyp).
• Biochemische Befunde: Die Zellen der Patienten zeigten eine reduzierte, aber nicht fehlende saure Ceramidase-Aktivität im Vergleich zu Kontrollen, während die Eltern intermediäre Werte aufwiesen, was konsistent mit einem autosomal-rezessiven Erbgang ist.
• Funktionelle Charakterisierung:
  • Spleißen: Die cDNA-Analyse bestätigte, dass die Variante kein aberrantes mRNA-Spleißen verursacht.
  • Proteinexpression: Western Blots zeigten, dass das mutierte p.Tyr43Asn-Protein exprimiert wird und eine autokatalytische Spaltung in die 14 kDa $\alpha$-Untereinheit durchläuft, im Gegensatz zur p.Cys143Ser-Kontrolle, welche keine Spaltung zeigte.
  • Enzymaktivität: Entgegen den Erwartungen für eine pathogene Variante basierend auf den Patientenzelldaten, führte die ektopische Expression der mutierten cDNA in kultivierten menschlichen Zellen zu einer sauren Ceramidase-Aktivität, die der mit der Wildtyp-cDNA erhaltenen Aktivität ähnelte.
  • Ceramid-Spiegel: Die Expression der p.Tyr43Asn-Mutante in Farber-Zellen reduzierte die intrazelluläre Ceramid-Akkumulation erfolgreich in demselben Maße wie das Wildtyp-Protein.
• ACMG-Klassifizierung: Basierend auf den Segregationsdaten, der Abwesenheit in Kontrollen, dem Vorhandensein in zwei nicht verwandten betroffenen Individuen mit einem konsistenten Phänotyp und den In-silico-Vorhersagen wird die Variante nach ACMG-Richtlinien als pathogen (IIIb) klassifiziert (PS4, PM1, PM2_supporting, PP2, PP4).

Bedeutung und Ansprüche
Die Autoren berichten über die Identifizierung einer neuen ASAH1-Variante (p.Tyr43Asn), die mit einem SMA- bis SMA-PME-Phänotyp-Spektrum bei indischen Individuen assoziiert ist, was auf einen möglichen Founder-Effekt hindeutet. Die Studie hebt die Bedeutung der Integration von genetischen, enzymatischen und klinischen Belegen hervor, um die Variantenpathogenität zu interpretieren.

Entscheidend ist, dass die Autoren behaupten, dass der pathogene Mechanismus dieser spezifischen Variante vom klassischen Modell der Ceramid-Akkumulation abweichen könnte. Obwohl die Variante mit einer reduzierten Enzymaktivität in patientenabgeleiteten Zellen assoziiert ist, zeigten funktionelle Assays in kultivierten menschlichen Zellen, dass das mutierte Protein eine katalytische Aktivität beibehält und die Ceramid-Akkumulation im gleichen Maße wie das Wildtyp-Protein korrigieren kann. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der primäre Krankheitsmechanismus bei diesen Patienten verschieden von der einfachen Ceramid-Akkumulation ist oder andere Mechanismen umfasst, die durch die verwendeten In-vitro-Modelle nicht erfasst werden. Die Studie unterstreicht die Komplexität der ASAH1-assoziierten Störungen und die Notwendigkeit, verschiedene Beleglinien zu kombinieren, um die Pathogenität von Varianten vollständig zu verstehen.