Identification and Functional Characterisation of a Novel ASAH1 Gene Variant in Two Unrelated Indian Individuals with Childhood-Onset Spinal Muscular Atrophy

Resumen Técnico: Identificación y Caracterización Funcional de una Nueva Variante del Gen ASAH1 en Dos Individuos Indios No Relacionados con Atrofia Muscular Espinal de Inicio en la Infancia

Planteamiento del Problema
Las variantes patogénicas en el gen ASAH1, que codifica la enzima lisosomal ceramidasa ácida (AC), causan un espectro de trastornos autosómicos recesivos que van desde la enfermedad de Farber grave hasta la Atrofia Muscular Espinal con Epilepsia Mioclónica Progresiva (SMA-PME). Generalmente se piensa que la gravedad clínica se correlaciona con la actividad enzimática residual, donde una deficiencia severa (<10%) conduce a la enfermedad de Farber y una actividad parcial (10–30%) se asocia con la SMA-PME. Sin embargo, el mecanismo molecular preciso que vincula variantes específicas con la variabilidad fenotípica, particularmente en casos donde los marcadores bioquímicos no se alinean completamente con la patogenicidad esperada, sigue siendo un área de investigación. Este estudio aborda la identificación y caracterización funcional de una nueva variante de sentido erróneo (missense) homocigota en dos pacientes indios no relacionados que presentan debilidad neuromuscular de inicio en la infancia, donde un caso exhibe características de SMA-PME y el otro un fenotipo de SMA pura.

Metodología
El estudio empleó un enfoque multidisciplinario que combinó genética clínica, bioquímica y biología celular:

• Análisis Genético: Se realizó la secuenciación del exoma completo (WES) en dos individuos afectados. Las variantes se filtraron utilizando bases de datos estándar (gnomAD, ClinVar, etc.) y se anotaron mediante herramientas como VEP y Sentieon. La secuenciación de Sanger confirmó la la cigocidad de la variante candidata en los pacientes y sus padres.
• Análisis de Transcritos: Se extrajo ARN de líneas celulares de linfoblastos transformadas por el virus de Epstein-Barr (EBV) derivadas de un paciente y sus padres para evaluar la presencia de un empalme (splicing) aberrante.
• Ensayos Funcionales:
  • Actividad Enzimática: La actividad de la ceramidasa ácida se midió en leucocitos y células linfoblásticas derivadas de pacientes mediante un ensayo fluorométrico.
  • Modelos Celulares: Células HEK293T y fibroblastos de la enfermedad de Farber (que carecen de actividad de AC) fueron transfectadas transitoriamente con el ADNc de la proteína tipo silvestre (WT) de ASAH1 o con la variante específica del paciente c.127T>A (p.Tyr43Asn). Un mutante patogénico conocido (c.428G>C, p.Cys143Ser) sirvió como control negativo.
  • Análisis de Proteínas: Se utilizó Western blot para detectar la expresión de la proteína AC y el procesamiento de la precursora.
  • Análisis Metabólico: Los niveles intracelulares de ceramida y dihidroceramida se cuantificaron mediante LC–MS/MS en las células transfectadas.
• Modelado In Silico: La variante fue analizada mediante múltiples algoritmos de predicción (SIFT, PolyPhen-2, REVEL, etc.) y herramientas de modelado estructural (HOPE) para evaluar el impacto potencial en la estructura y estabilidad de la proteína.

Resultos Clave

• Identificación de la Variante: El WES identificó una nueva variante homocigota de sentido erróneo, c.127T>A (p.Tyr43Asn), en el exón 3 del gen ASAH1 en ambos pacientes no relacionados. La variante estaba ausente en bases de datos públicas (gnomAD) y se confirmó en estado heterocigoto en ambos grupos de progenitores.
• Fenotipos Clínicos:
  • Caso 1: Un varón de 12 años con debilidad muscular proximal de inicio en la infancia, fasciculaciones linguales y signo de Gower, pero sin convulsiones ni mioclonías (fenotipo SMA).
  • Caso 2: Una mujer de 19 años con debilidad similar de inicio que posteriormente desarrolló convulsiones tónico-clónicas generalizadas, mioclonías y distonía (fenotipo SMA-PME).
• Hallazgos Bioquímicos: Las células de los pacientes mostraron una actividad de ceramidasa ácida reducida, pero no nula, en comparación con los controles, mientras que los padres exhibieron niveles intermedios, lo cual es consistente con la herencia autosómica recesiva.
• Caracterización Funcional:
  • Empalme (Splicing): El análisis de ADNc confirmó que la variante no causa un empalme de ARNm aberrante.
  • Expresión de Proteínas: Los Western blots mostraron que la proteína mutante p.Tyr43Asn se expresa y experimenta el procesamiento autocatalítico en la subunidad alfa de 14 kDa, a diferencia del control p.Cys143Ser, que no logró el procesamiento.
  • Actividad Enzimática: Contrariamente a las expectativas para una variante patogénica basadas en los datos de las células de los pacientes, la expresión ectópica del ADNc mutante en células humanas cultivadas produjo una actividad de ceramidasa ácida similar a la obtenida con el ADNc de tipo silvestre.
  • Niveles de Ceramida: La expresión de la proteína mutante p.Tyr43Asn en células de Farber redujo con éxito la acumulación intracelular de ceramida al mismo nivel que la proteína de tipo silvestre.
• Clasificación ACMG: Basándose en los datos de segregación, la ausencia en controles, la presencia en dos individuos afectados no relacionados con un fenotipo consistente y las predicciones in silico, la variante se clasifica como patogénica (IIIb) según las directrices de la ACMG (PS4, PM1, PM2_supporting, PP2, PP4).

Significancia y Reivindicaciones
Los autores informan la identificación de una nueva variante de ASAH1 (p.Tyr43Asn) asociada con un espectro fenotípico de SMA a SMA-PME en individuos indios, lo que sugiere un posible efecto fundador. El estudio destaca la importancia de integrar la evidencia genética, enzimática y clínica para la interpretación de variantes.

Crucialmente, el estudio afirma que el mecanismo patogénico de esta variante específica puede diferir del modelo clásico de acumulación de ceramida. Si bien la variante está asociada con una reducción de la actividad enzimática en las células derivadas de los pacientes, los ensayos funcionales en células humanas cultivadas demostraron que la proteína mutante conserva la actividad catalítica y puede corregir la acumulación de ceramida en la misma medida que la proteína de tipo silvestre. Este hallazgo sugiere que el mecanismo primario subyacente a la enfermedad en estos pacientes es distinto de la simple acumulación de ceramida o involucra mecanismos adicionales no capturados por los modelos in vitro utilizados. El estudio subraya la complejidad de los trastornos relacionados con ASAH1 y la necesidad de combinar diversas líneas de evidencia para comprender plenamente la patogenicidad de las variantes.