Identification and Functional Characterisation of a Novel ASAH1 Gene Variant in Two Unrelated Indian Individuals with Childhood-Onset Spinal Muscular Atrophy

Résumé Technique : Identification et caractérisation fonctionnelle d'un nouveau variant du gène ASAH1 chez deux individus non apparentés d'origine indienne présentant une amyotrophie spinale à début infantile

Énoncé du problème
Les variants pathogènes du gène ASAH1, qui code pour l'enzyme lysosomale céramidase acide (AC), causent un spectre de troubles autosomiques récessifs allant de la maladie de Farber sévère à l'amyotrophie spinale avec épilepsie myoclonique progressive (SMA-PME). On considère généralement que la sévérité clinique est corrélée à l'activité enzymatique résiduelle, où une déficience sévère (<10 %) conduit à la maladie de Farber et une activité partielle (10–30 %) est associée à la SMA-PME. Cependant, les mécanismes moléculaires précis reliant des variants spécifiques à la variabilité phénotypique, particulièrement dans les cas où les marqueurs biochimiques ne s'alignent pas totalement sur la pathogénicité attendue, restent un domaine de recherche. Cette étude traite de l'identification et de la caractérisation fonctionnelle d'un nouveau variant faux-sens homozygote chez deux patients non apparentés présentant une faiblesse neuromusculaire à début infantile, l'un des cas présentant des caractéristiques de SMA-PME et l'autre un phénotype SMA pur.

Méthodologie
L'étude a employé une approche multidisciplinaire combinant la génétique clinique, la biochimie et la biologie cellulaire :

• Analyse génétique : Le séquençage de l'exome entier (WES) a été réalisé sur deux individus affectés. Les variants ont été filtrés à l'aide de bases de données standards (gnomAD, ClinVar, etc.) et annotés à l'aide d'outils tels que VEP et Sentieon. Le séquençage Sanger a confirmé la zygocité du variant candidat chez les patients et leurs parents.
• Analyse de l'ARN : L'ARN a été extrait de lignées de lymphocytes transformés par le virus d'Epstein-Barr (EBV) issues d'un patient et de ses parents pour évaluer un épissage aberrant.
• Essais fonctionnels :
  • Activité enzymatique : L'activité de la céramidase acide a été mesurée dans les leucocytes et les cellules lymphoblastoïdes dérivés de patients à l'aide d'un essai fluorimétrique.
  • Modèles cellulaires : Des cellules HEK293T et des fibroblastes de la maladie de Farber (dépourvus d'activité AC) ont été transfectés de manière transitoire avec l'ADNc sauvage (WT) d'ASAH1 ou le variant spécifique au patient c.127T>A (p.Tyr43Asn). Un mutant pathogène connu (c.428G>C, p.Cys143Ser) a servi de témoin négatif.
  • Analyse des protéines : Le Western blot a été utilisé pour détecter l'expression de la protéine AC et le clivage du précurseur.
  • Analyse métabolique : Les niveaux intracellulaires de céramide et de dihydrocéramide ont été quantifiés via LC–MS/MS dans les cellules transfectées.
• Modélisation in silico : Le variant a été analysé par plusieurs algorithmes de prédiction (SIFT, PolyPhen-2, REVEL, etc.) et des outils de modélisation structurelle (HOPE) pour évaluer les impacts potentiels sur la structure et la stabilité de la protéine.

Résultats clés

• Identification du variant : Le WES a identifié un nouveau variant faux-sens homozygote, c.127T>A (p.Tyr43Asn), dans l'exon 3 du gène ASAH1 chez les deux patients non apparentés. Le variant était absent des bases de données publiques (gnomAD) et a été confirmé à l'état hétérozygote chez les deux ensembles de parents.
• Phénotypes cliniques :
  • Cas 1 : Un garçon de 12 ans présentant une faiblesse musculaire proximale à début infantile, des fasciculations de la langue et un signe de Gower, mais sans crises ni myoclonus (phénotype SMA).
  • Cas 2 : Une femme de 19 ans présentant une faiblesse similaire à l'apparition, qui a développé plus tard des crises tonico-cloniques généralisées, un myoclonus et une dystonie (phénotype SMA-PME).
• Données biochimiques : Les cellules des patients présentaient une activité céramidase acide réduite, mais non nulle, par rapport aux contrôles, tandis que les parents présentaient des niveaux intermédiaires, ce qui est cohérent avec une hérédité autosomique récessive.
• Caractérisation fonctionnelle :
  • Épissage : L'analyse de l'ADNc a confirmé que le variant ne provoque pas d'épissage aberrant de l'ARNm.
  • Expression des protéines : Les Western blots ont montré que la protéine mutante p.Tyr43Asn est exprimée et subit un clivage autocatalytique en la sous-unité alpha de 14 kDa, contrairement au contrôle p.Cys143Ser qui n'a pas réussi à se cliver.
  • Activité enzymatique : Contrairement aux attentes pour un variant pathogène basées sur les données des cellules de patients, l'expression ectopique de l'ADNc mutant dans des cellules humaines cultivées a conduit à une activité de la céramidase acide similaire à celle obtenue avec l'ADNc sauvage.
  • Niveaux de céramide : L'expression du mutant p.Tyr43Asn dans des cellules de Farber a réussi à réduire l'accumulation intracellulaire de céramide au même niveau que la protéine sauvage.
• Classification ACMG : Sur la base des données de ségrégation, de l'absence dans les contrôles, de la présence chez deux individus affectés non apparentés avec un phénotype cohérent et des prédictions in silico, le variant est classé comme pathogène (IIIb) selon les directives de l'ACMG (PS4, PM1, PM2_supporting, PP2, PP4).

Signification et revendications
Les auteurs rapportent l'identification d'un nouveau variant d'ASAH1 (p.Tyr43Asn) associé à un spectre phénotypique allant de la SMA à la SMA-PME chez des individus indiens, suggérant un effet fondateur. L'étude souligne l'importance d'intégrer les preuves génétiques, enzymatiques et cliniques pour l'interprétation des variants.

De manière cruciale, l'article soutient que le mécanisme pathogène de ce variant spécifique pourrait différer du modèle classique d'accumulation de céramide. Bien que le variant soit associé à une réduction de l'activité enzymatique dans les cellules dérivées de patients, les essais fonctionnels dans des cellules humaines cultivées ont démontré que la protéine mutante conserve une activité catalytique et peut corriger l'accumulation de céramide autant que la protéine sauvage. Cette découverte suggère que le mécanisme primaire sous-jacent à la maladie chez ces patients est distinct d'une simple accumulation de céramide ou implique des mécanismes supplémentaires non capturés par les modèles in vitro utilisés. L'étude souligne la complexité des troubles liés à ASAH1 et la nécessité de combiner diverses lignes de preuve pour comprendre pleinement la pathogénicité des variants.