Identification and Functional Characterisation of a Novel ASAH1 Gene Variant in Two Unrelated Indian Individuals with Childhood-Onset Spinal Muscular Atrophy

Resumo Técnico: Identificação e Caracterização Funcional de uma Nova Variante do Gene ASAH1 em Dois Indivíduos Não Relacionados da Índia com Atrofia Muscular Espinhal de Início na Infância

Problema
Variantes patogênicas no gene ASAH1, que codifica a enzima lisossômica ceramidase ácida (AC), causam um espectro de distúrbios autossômicos recessivos que variam desde a doença de Farber grave até a Atrofia Muscular Espinhal com Epilepsia Mioclônica Progressiva (SMA-PME). Assume-se, geralmente, que a gravidade clínica correlaciona-se com a atividade enzimática residual, onde a deficiência grave (<10%) leva à doença de Farber e a atividade parcial (10–30%) está associada à SMA-PME. No entanto, os mecanismos moleculares precisos que ligam variantes específicas à variabilidade fenotípica, particularmente em casos onde os marcadores bioquímicos não se alinham totalmente com a patogenicidade esperada, permanecem uma área de investigação. Este estudo aborda a identificação e a caracterização funcional de uma nova variante missense homozigótica em dois pacientes não relacionados da Índia que apresentam fraqueza neuromuscular de início na infância, com um caso exibindo características de SMA-PME e o outro um fenótipo de SMA pura.

Metodologia
O estudo empregou uma abordagem multidisciplinar combinando genética clínica, bioquímica e biologia celular:

• Análise Genética: O sequenciamento do exoma completo (WES) foi realizado em dois indivíduos afetados. As variantes foram filtradas usando bancos de dados padrão (gnomAD, ClinVar, etc.) e anotadas utilizando ferramentas como VEP e Sentieon. O sequenciamento de Sanger confirmou a zigocidade da variante candidata nos pacientes e em seus pais.
• Análise de Transcritos: O RNA foi extraído de linhagens de linfoblastoides transformadas pelo Vírus Epstein-Barr (EBV) derivadas de um paciente e de seus pais para avaliar o splicing aberrante.
• Ensaios Funcionais:
  • Atividade Enzimática: A atividade da ceramidase ácida foi medida em leucócitos derivados de pacientes e células linfoblastoides usando um ensaio fluorométrico.
  • Modelos Celulares: Células HEK293T e fibroblastos de pacientes com doença de Farber (sem atividade de AC) foram transfectadas transitoriamente com cDNA de ASAH1 do tipo selvagem (WT) ou com a variante específica do paciente c.127T>A (p.Tyr43Asn). Um mutante patogênico conhecido (c.428G>C, p.Cys143Ser) serviu como controle negativo.
  • Análise de Proteína: O Western blotting foi utilizado para detectar a expressão da proteína AC e a clivagem do precursor.
  • Análise Metabólica: Os níveis intracelulares de ceramida e diidroceramida foram quantificados via LC–MS/MS em células transfectadas.
• Modelagem In Silico: A variante foi analisada por múltiplos algoritmos de predição (SIFT, PolyPhen-2, REVEL, etc.) e ferramentas de modelagem estrutural (HOPE) para avaliar os potenciais impactos na estrutura e estabilidade da proteína.

Principais Resultados

• Identificação da Variante: O WES identificou uma nova variante missense homozigótica, c.127T>A (p.Tyr43Asn), no exon 3 do gene ASAH1 em ambos os pacientes não relacionados. A variante estava ausente em bancos de dados públicos (gnomAD) e foi confirmada no estado heterozigoto em ambos os conjuntos de pais.
• Fenótipos Clínicos:
  • Caso 1: Um homem de 12 anos com fraqueza muscular proximal de início na infância, fasciculações linguais e sinal de Gower, mas sem convulsões ou mioclonia (fenótipo SMA).
  • Caso 2: Uma mulher de 19 anos com fraqueza de início semelhante que posteriormente desenvolveu convulsões tônico-clônicas generalizadas, mioclonia e distonia (fenótipo SMA-PME).
• Achados Bioquímicos: As células dos pacientes mostraram atividade de ceramidase ácida reduzida, mas não nula, em comparação aos controles, enquanto os pais exibiram níveis intermediários, consistentes com a herança autossômica recessiva.
• Caracterização Funcional:
  • Splicing: A análise de cDNA confirmou que a variante não causa splicing de mRNA aberrante.
  • Expressão de Proteína: Western blots mostraram que a proteína mutante p.Tyr43Asn é expressa e passa pelo processo de clivagem autocatalítica em uma subunidade alfa de 14 kDa, ao contrário do controle p.Cys143Ser, que falhou na clivagem.
  • Atividade Enzimática: Contrariamente às expectativas para uma variante patogênica baseadas nos dados das células dos pacientes, a expressão ectópica do cDNA mutante em células humanas cultivadas resultou em atividade de ceramidase ácida semelhante à obtida com o cDNA do tipo selvagem.
  • Níveis de Ceramida: A expressão da variante p.Tyr43Asn em células Farber reduziu com sucesso o acúmulo intracelular de ceramida na mesma medida que a proteína do tipo selvagem.
• Classificação ACMG: Com base nos dados de segregação, ausência em controles, presença em dois indivíduos afetados não relacionados com um fenótipo consistente e predições in silico, a variante é classificada como patogênica (IIIb) pelas diretrizes do ACMG (PS4, PM1, PM2_supporting, PP2, PP4).

Significância e Alegações
Os autores relatam a identificação de uma nova variante de ASAH1 (p.Tyr43Asn) associada a um espectro fenotípico de SMA a SMA-PME em indivíduos indianos, sugerindo um possível efeito fundador. O estudo destaca a importância de integrar evidências genéticas, enzimáticas e clínicas para a interpretação de variantes.

Crucialmente, o artigo alega que o mecanismo patogênico desta variante específica pode diferir do modelo clássico de acúmulo de ceramida. Embora a variante esteja associada à redução da atividade enzimática nas células derivadas de pacientes, ensaios funcionais em células humanas cultivadas demonstraram que a proteína mutante retém atividade catalítica e pode corrigir o acúmulo de ceramida na mesma medida que a proteína do tipo selvagem. Este achado sugere que o mecanismo primário subjacente à doença nesses pacientes é distinto do simples acúmulo de ceramida ou envolve mecanismos adicionais não capturados pelos modelos in vitro utilizados. O estudo ressalta a complexidade dos distúrbios relacionados ao ASAH1 e a necessidade de combinar diversas linhas de evidência para compreender plenamente a patogenicidade das variantes.