Incoherent Holographic Lattice Light-Sheet Microscopy for Low-Signal Volumetric Imaging

आधुनिक तंत्रिका विज्ञान (न्यूरोसाइंस) के सामने मौजूद चुनौती को समझने के लिए, सबसे पहले किसी को तीन आयामों (थ्री-डी) में एक जीवित मस्तिष्क को देखने के सूक्ष्म कार्य की कल्पना करनी होगी। वैज्ञानिक लंबे समय से यह देखने का प्रयास कर रहे हैं कि तंत्रिका कोशिकाओं के बीच संकेत कैसे यात्रा करते हैं, एक ऐसी प्रक्रिया जिसमें अक्सर कैल्शियम के छोटे विस्फोट या रासायनिक संदेशवाहकों का निकलना शामिल होता है। इन घटनाओं को स्पष्ट रूप से देखने के लिए, शोधकर्ता 'लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी' नामक तकनीक का उपयोग करते हैं, जो प्रकाश की एक पतली परत के साथ ऊतक (टिशू) के एक सूक्ष्म स्लाइस को प्रकाशित करती है, ठीक वैसे ही जैसे एक चाकू ब्रेड के लोफ को काटकर उसके अंदर की परतों को प्रकट करता है। यह विधि नमूने के लिए कोमल है और छवियों को तेजी से कैप्चर करती है। हालाँकि, एक महत्वपूर्ण समस्या तब उत्पन्न होती है जब वैज्ञानिकों को नमूने के साथ अन्य उपकरण जोड़ने की आवश्यकता होती है, जैसे कि कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इलेक्ट्रोड या दवा देने के लिए ट्यूब। पारंपरिक सेटअप में, ऊतक के पूरे आयतन (वॉल्यूम) को स्कैन करने के लिए, या तो नमूने को स्वयं प्रकाश के माध्यम से घुमाना पड़ता है, या माइक्रोस्कोप के लेंस को ऊपर-नीचे करना पड़ता है। यदि नमूना तारों या ट्यूबों द्वारा स्थिर किया गया है, तो उसे हिलाना असंभव हो जाता है, और भारी लेंस को हिलाने से नाजुक कनेक्शन या जुड़े हुए उपकरणों की स्थिति बाधित हो सकती है। इस यांत्रिक संघर्ष ने उन प्रयोगों में तीव्र, त्रि-आयामी सिग्नलिंग का अध्ययन करने की क्षमता को सीमित कर दिया है जिनमें स्थिर उपकरणों की आवश्यकता होती है।

इलिनोइस विश्वविद्यालय शिकागो के शोधकर्ताओं की एक टीम ने, दक्षिण फ्लोरिडा विश्वविद्यालय और उत्तरी एरिज़ोना विश्वविद्यालय के सहयोगियों के साथ मिलकर, इस समस्या को हल करने का एक नया तरीका विकसित किया है। उन्होंने एक ऐसा माइक्रोस्कोप सिस्टम बनाया है जो नमूने और मुख्य लेंस दोनों को पूरी तरह से स्थिर रखता है, फिर भी पूर्ण 3D दृश्य कैप्चर करता है। अलग-अलग गहराइयों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए हिस्सों को हिलाने के बजाय, उनका सिस्टम 'इनकोहेरेंट होलोग्राफी' नामक एक विशेष ऑप्टिकल ट्रिक का उपयोग करता है। इस दृष्टिकोण में, कोशिकाओं द्वारा उत्सर्जित प्रकाश को इस तरह रिकॉर्ड किया जाता है कि वह अपनी गहराई के बारे में जानकारी सुरक्षित रखता है, जिससे कंप्यूटर तस्वीर लेने के बाद ऊतक के भीतर किसी भी तल (प्लेन) पर छवि को गणितीय रूप से पुनः केंद्रित (रीफोकस) कर सकता है। इस होलोग्राफिक डिटेक्शन को 'लैटिस लाइट-शीट इल्यूमिनेशन' के साथ जोड़कर, उन्होंने एक ऐसा उपकरण बनाया है जहाँ केवल माइक्रोस्कोप के भीतर एक छोटा दर्पण प्रकाश की शीट को नमूने के माध्यम से घुमाने (स्वीप करने) के लिए चलता है। डिटेक्शन लेंस कभी नहीं हिलता, जिसका अर्थ है कि नमूने से जुड़े कोई भी इलेक्ट्रोड या ट्यूब स्थिर और अप्रभावित रहते हैं।

शोधकर्ताओं ने अपने इस नए सिस्टम का परीक्षण किया, जिसे वे 'इनकोहेरेंट होलोग्राफिक लैटिस लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी' कहते हैं, और इसके लिए उन्होंने दो प्रकार के प्रयोगों का उपयोग किया। सबसे पहले, उन्होंने यह देखने के लिए कि छवियां कितनी स्पष्ट हैं, एक एकल कोशिका से भी छोटे, फ्लोरोसेंट प्लास्टिक मोतियों (बीड्स) का उपयोग किया। उन्होंने पाया कि यह सिस्टम इन मोतियों को बेहतरीन पारंपरिक माइक्रोस्कोपों के समान स्पष्टता के साथ दिखा सकता है, और वह भी बिना किसी जटिल सॉफ्टवेयर के छवि को साफ किए। मोती लगभग 0.33 की चौड़ाई के साथ स्पष्ट बिंदु के रूप में दिखाई दिए, जिससे यह सिद्ध हुआ कि होलोग्राफिक विधि लेंस को स्थिर रखने के उद्देश्य से छवि की गुणवत्ता से समझौता नहीं करती है। उन्होंने इन मोतियों की स्थिति को समय के साथ ट्रैक भी किया, और यह सुनिश्चित करने के लिए कई मिनटों तक उन्हें देखा कि क्या सिस्टम संकेतों का पीछा करते हुए ट्रैक खो देता है। मापन ने दिखाया कि सिस्टम इन बिंदुओं के स्थान और चमक का विश्वसनीय रूप से पता लगा सकता है, जिसमें ऐसी स्थिरता है जो बताती है कि यह अधिक जटिल जैविक कार्यों के लिए तैयार है।

इसके बाद, टीम एक जीवित कोशिका पर आगे बढ़ी, विशेष रूप से एक मोटर न्यूरॉन जैसी सेल लाइन, जिसे उनकी आंतरिक संरचनाओं को उजागर करने के लिए एक हरे रंग के डाई से लेबल किया गया था। इन घने नमूनों में, जहाँ हजारों प्रकाश उत्सर्जक बिंदु पास-पास पैक होते हैं, शोधकर्ताओं को एक प्राकृतिक सीमा का सामना करना पड़ा। क्योंकि बहुत सारे उत्सर्जक होलोग्राफिक रिकॉर्ड में ओवरलैप होते हैं, इसलिए एक स्पष्ट छवि बनाने के लिए आवश्यक स्पष्ट हस्तक्षेप पैटर्न (इंटरफेरेंस पैटर्न) धुंधले हो गए, जिनकी दृश्यता केवल छह प्रतिशत थी। हालांकि कोशिकीय संरचनाएं दिखाई दे रही थीं, लेकिन सिस्टम को कई छवियों को एक साथ औसत (एवरेज) किए बिना इन भीड़भाड़ वाले क्षेत्रों में सूक्ष्म विवरणों को पहचानने में कठिनाई हुई। यह निष्कर्ष महत्वपूर्ण है क्योंकि यह तकनीक की सीमा को परिभाषित करता है: यह विरल (स्पार्स), चमकीले संकेतों के लिए—जैसे कि वह विशिष्ट हॉटस्पॉट जहाँ कैल्शियम एक तंत्रिका कोशिका में प्रवेश करता है—असाधारण रूप से अच्छा काम करता है, लेकिन जब पूरा ऊतक सघन रूप से लेबल किया जाता है, तो इसे चुनौतियों का सामना करना पड़ता है।

यह अध्ययन यह दावा नहीं करता है कि इसने तुरंत हर प्रकार के मस्तिष्क सिग्नल की समस्या को हल कर दिया है। शोधकर्ताओं ने स्पष्ट रूप से कहा कि उन्होंने इस कार्य में वास्तविक कैल्शियम ट्रांजिएंट या न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज को नहीं मापा है; इसके बजाय, उन्होंने भविष्य के अध्ययनों के लिए पद्धतिगत आधार तैयार किया है जो ऐसा करेंगे। उन्होंने प्रदर्शित किया कि उनका सिस्टम बहुत कम प्रकाश स्तरों पर भी काम कर सकता है, जो प्रति फ्रेम दस मिलीसेकंड जितनी कम अवधि में चित्र कैप्चर कर सकता है, जो तीव्र जैविक घटनाओं को पकड़ने के लिए पर्याप्त तेज़ है। उन्होंने यह भी पुष्टि की कि उनके द्वारा उपयोग किया गया गणितीय मॉडल, जो यह भविष्यवाणी करता है कि सिस्टम विभिन्न गहराइयों पर कैसे फोकस करता है, सटीक था, जिससे उन विशिष्ट तलों की पहचान हुई जहाँ छवि स्वाभाविक रूप से एक स्पष्ट बिंदु में सिमट जाती है, जो कंप्यूटर को यह जानने में मदद करता है कि बिना किसी भौतिक सेंसर के कहाँ फोकस करना है।

इस कार्य का अंतिम लक्ष्य यह सक्षम करना है कि जीवित मस्तिष्क ऊतक में न्यूरॉन्स कैसे संवाद करते हैं, जबकि उत्तेजना इलेक्ट्रोड को पूरी तरह से स्थिर रखा जा सके। डिटेक्शन लेंस को हिलाने की आवश्यकता को हटाकर, यह सिस्टम उन प्रयोगों के द्वार खोलता है जहाँ विद्युत उत्तेजना और दवा वितरण को उच्च-गति, त्रि-आयामी इमेजिंग के साथ जोड़ा जा सकता है। जबकि वर्तमान परिणाम दिखाते हैं कि घनी आबादी वाली कोशिकाएं ओवरलैपिंग लाइट सिग्नल्स के कारण एक चुनौती पेश करती हैं, यह सिस्टम उन विरल, चमकीले संकेतों के लिए शानदार प्रदर्शन करता है जो विशिष्ट तंत्रिका घटनाओं की विशेषता हैं। यह शोध अवलोकन के एक नए युग की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है, जहाँ चलते हुए हिस्सों की भौतिक बाधाएं अब मस्तिष्क की जटिल मशीनरी को चलते हुए देखने की क्षमता को सीमित नहीं करेंगी। यह कार्य पुष्टि करता है कि नमूने और लेंस को स्थिर रखना केवल एक सैद्धांतिक संभावना नहीं है, बल्कि एक व्यावहारिक वास्तविकता है, बशर्ते कि देखे जाने वाले संकेत बैकग्राउंड शोर से अलग होने के लिए पर्याप्त स्पष्ट हों।