Incoherent Holographic Lattice Light-Sheet Microscopy for Low-Signal Volumetric Imaging

Pour comprendre le défi auquel est confrontée la neuroscience moderne, il faut d'abord imaginer la tâche délicate que représente l'observation d'un cerveau vivant en trois dimensions. Les scientifiques cherchent depuis longtemps à observer comment les signaux voyagent entre les cellules nerveuses, un processus qui implique souvent de minuscules bouffées de calcium ou la libération de messagers chimiques. Pour voir ces événements clairement, les chercheurs utilisent une technique appelée microscopie à feuille de lumière, qui illumine une fine tranche de tissu avec une feuille de lumière, un peu comme un couteau tranchant une miche de pain pour en révéler les couches intérieures. Cette méthode est douce pour l'échantillon et capture les images rapidement. Cependant, un problème important surgit lorsque les scientifiques doivent fixer d'autres outils à l'échantillon, tels que des électrodes pour stimuler les cellules ou des tubes pour administrer des médicaments. Dans les configurations traditionnelles, pour balayer tout le volume du tissu, soit l'échantillon lui-même doit être déplacé à travers la lumière, soit la lentille du microscope doit se déplacer de haut en bas. Si l'échantillon est maintenu par des fils ou des tubes, le déplacer devient impossible, et le déplacement de la lentille lourde peut perturber les connexions délicates ou la position des outils fixés. Ce conflit mécanique a limité la capacité d'étudier la signalisation tridimensionnelle rapide dans des expériences nécessitant un équipement fixe.

Une équipe de chercheurs de l'Université de l'Illinois à Chicago, accompagnée de collègues de l'Université du Sud de la Floride et de l'Université du Nord de l'Arizona, a développé une nouvelle façon de résoudre ce problème. Ils ont créé un système de microscope qui maintient l'échantillon et la lentille principale parfaitement immobiles tout en capturant une vue complète en 3D. Au lieu de déplacer des pièces pour faire la mise au point sur différentes profondeurs, leur système utilise un tour de passe-passe optique spécial appelé holographie incohérente. Dans cette approche, la lumière émise par les cellules est enregistrée de manière à préserver l'information sur sa profondeur, permettant à un ordinateur de refaire la mise au point mathématiquement sur n'importe quel plan à l'intérieur du tissu après que l'image a été prise. En combinant cette détection holographique avec une illumination par feuille de lumière en réseau (lattice light-sheet), ils ont construit un dispositif où seul un petit miroir à l'intérieur du microscope se déplace pour balayer la feuille de lumière à travers l'échantillon. La lentille de détection ne bouge jamais, ce qui signifie que les électrodes ou les tubes attachés à l'échantillon restent stables et ne sont pas perturbés.

Les chercheurs ont testé ce nouveau système, qu'ils appellent microscopie à feuille de lumière en réseau holographique incohérente, en utilisant deux types d'expériences. Premièrement, ils ont utilisé de minuscules billes de plastique fluorescentes, plus petites qu'une seule cellule, pour voir la netteté des images. Ils ont constaté que le système pouvait résoudre ces billes avec une clarté comparable aux meilleurs microscopes conventionnels, même sans utiliser de logiciel complexe pour nettoyer l'image. Les billes apparaissaient comme des points distincts avec une largeur d'environ 0,33, prouvant que la méthode holographique ne sacrifie pas la qualité de l'image au profit du maintien immobile de la lentille. Ils ont également suivi la position de ces billes au fil du temps, les observant pendant plusieurs minutes pour s'assurer que le système pouvait suivre les signaux sans perdre la trace. Les mesures ont montré que le système pouvait détecter de manière fiable la position et la luminosité de ces points, avec une stabilité qui suggère qu'il est prêt pour des tâches biologiques plus complexes.

Ensuite, l'équipe est passée aux cellules vivantes, spécifiquement une lignée de cellules de type motoneurone marquée avec un colorant vert pour mettre en évidence leurs structures internes. Dans ces échantillons denses, où des milliers de points émetteurs sont regroupés étroitement, les chercheurs ont rencontré une limite naturelle. Parce que de nombreux émetteurs se chevauchent dans l'enregistrement holographique, les motifs d'interférence clairs nécessaires pour former une image nette sont devenus faibles, avec une visibilité d'environ six pour cent. Bien que les structures cellulaires soient visibles, le système peinait à résoudre les détails fins dans ces zones encombrées sans moyen de combiner plusieurs images. Cette découverte est cruciale car elle définit la limite de la technologie : elle fonctionne exceptionnellement bien pour les signaux clairsemés et brillants, comme les points chauds spécifiques où le calcium pénètre dans une cellule nerveuse, mais elle rencontre des difficultés lorsque l'ensemble du tissu est marqué de manière dense.

L'étude ne prétend pas avoir résolu immédiatement le problème de l'imagerie de tous les types de signaux cérébraux. Les chercheurs déclarent explicitement qu'ils n'ont pas mesuré de réels transitoires de calcium ou de libération de neurotransmetteurs dans ce travail ; au contraire, ils ont posé le fondement méthodologique pour de futures études qui le feront. Ils ont démontré que le système peut fonctionner avec des niveaux de lumière très bas, capturant des images en seulement dix millisecondes par image, ce qui est assez rapide pour saisir des événements biologiques rapides. Ils ont également confirmé que le modèle mathématique qu'ils ont utilisé pour prédire comment le système fait la mise au point à différentes profondeurs était précis, identifiant des plans spécifiques où l'image s'effondre naturellement en un point net, ce qui aide l'ordinateur à savoir exactement où faire la mise au point sans avoir besoin d'un capteur physique.

Le but ultime de ce travail est de permettre l'étude de la communication des neurones dans le tissu cérébral vivant tout en maintenant les électrodes de stimulation parfaitement immobiles. En éliminant la nécessité de déplacer la lentille de détection, le système ouvre la porte à des expériences où la stimulation électrique et l'administration de médicaments peuvent être combinées avec une imagerie tridimensionnelle à haute vitesse. Bien que les résultats actuels montrent que les cellules densément compactées présentent un défi en raison du chevauchement des signaux lumineux, le système fonctionne magnifiquement pour les signaux clairsemés et brillants qui sont caractéristiques d'événements neuraux spécifiques. Cette recherche représente une étape significative vers une nouvelle ère d'observation en neurosciences, où les contraintes physiques des pièces mobiles ne limitent plus la capacité d'observer la machinerie complexe du cerveau en action. Le travail confirme que maintenir l'échantillon et la lentille fixes n'est pas seulement une possibilité théorique, mais une réalité pratique, à condition que les signaux observés soient assez distincts pour être séparés du bruit de fond.