Incoherent Holographic Lattice Light-Sheet Microscopy for Low-Signal Volumetric Imaging

현대 신경과학이 직면한 과제를 이해하려면, 먼저 살아있는 뇌를 3차원으로 관찰하는 섬세한 작업을 상상해 보아야 한다. 과학자들은 신경 세포 사이에서 신호가 어떻게 이동하는지, 즉 칼슘의 미세한 분출이나 화학적 메신저의 방출을 관찰하기 위해 오랫동안 노력해 왔다. 이러한 사건들을 명확하게 보기 위해 연구자들은 라이트 시트 현미경(light-sheet microscopy)이라는 기술을 사용하는데, 이는 마치 식빵 내부의 층을 드러내기 위해 칼로 빵을 얇게 써는 것처럼, 빛의 얇은 막으로 조직의 얇은 단면을 비추는 방식이다. 이 방법은 샘플에 무리를 주지 않으며 이미지를 빠르게 포착한다. 그러나 과학자들이 세포를 자극하기 위한 전극이나 약물을 전달하기 위한 튜브와 같은 다른 도구들을 샘플에 부착해야 할 때 중대한 문제가 발생한다. 전통적인 설정에서는 조직 전체의 부피를 스캔하기 위해 샘-플 자체를 빛 속으로 이동시키거나 현미경 렌즈를 위아래로 움직여야 한다. 만약 샘플이 전선이나 튜브에 의해 고정되어 있다면 움직이는 것이 불가능해지며, 무거운 렌즈를 움직이는 것은 부착된 도구들의 위치나 섬세한 연결을 방해할 수 있다. 이러한 기계적 충돌은 고정된 장비가 필요한 실험에서 신속한 3차원 신호 전달을 연구하는 능력을 제한해 왔다.

일리노이 대학교 시카고 캠퍼스의 연구진은 사우스 플로리다 대학교 및 노던 애리조나 대학교의 동료들과 함께 이 문제를 해결할 새로운 방법을 개발했다. 그들은 샘플과 주요 렌즈를 모두 완벽하게 정지 상태로 유지하면서도 여전히 완전한 3D 뷰를 포착할 수 있는 현미경 시스템을 만들었다. 이들은 서로 다른 깊이에 초점을 맞추기 위해 부품을 움직이는 대신, 비간섭 홀로그래피(incoherent holography)라는 특별한 광학적 기법을 사용한다. 이 접근 방식에서는 세포에서 방출되는 빛을 깊이에 대한 정보가 보존되는 방식으로 기록하여, 사진을 찍은 후 컴퓨터가 조직 내의 어떤 평면으로도 이미지를 수학적으로 재초점(refocus)을 맞출 수 있게 한다. 이 홀로그래피 검출법을 격자 라이트 시트(lattice light-sheet) 조명과 결합함으로써, 그들은 현미경 내부의 작은 거울만이 움직여 빛의 시트를 샘플 전체에 훑도록 하는 장치를 구축했다. 검출 렌즈는 움직이지 않으므로, 샘플에 부착된 전극이나 튜브는 안정적이고 방해받지 않은 상태로 유지된다.

연구진은 이 새로운 시스템을 '비간섭 홀로그래피 격자 라이트 시트 현미경(incoherent holographic lattice light-sheet microscopy)'이라 명명하고 두 가지 유형의 실험을 통해 테스트했다. 첫째, 단일 세포보다 작은 형광 플라스틱 비드를 사용하여 이미지의 선명도가 얼마나 높은지 확인했다. 그 결과, 이 시스템은 복잡한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 정화하지 않고도 기존의 우수한 현미경들과 대등한 수준의 선명도로 비드를 분해할 수 있음을 발견했다. 비드들은 약 0.33의 폭을 가진 뚜렷한 점으로 나타났으며, 이는 홀로그래피 방식이 렌즈를 고정하기 위해 이미지 품질을 희생하지 않는다는 것을 입증했다. 또한 이들은 몇 분 동안 비드의 위치를 추적하며 시스템이 신호를 놓치지 않고 따라갈 수 있는지 관찰했다. 측정 결과, 시스템은 이 점들의 위치와 밝기를 안정적으로 감지할 수 있었으며, 이는 더 복잡한 생물학적 과업을 수행할 준비가 되었음을 시사하는 안정성을 보여주었다.

다음으로, 팀은 녹색 염료로 표지된 모터 뉴런 유사 세포주를 포함한 살아있는 세포 실험으로 넘어갔다. 수천 개의 빛 방출 지점이 밀집해 있는 이 조밀한 샘플에서 연구진은 자연적인 한계에 부딪혔다. 너무 많은 방출체가 홀로그래피 기록에 겹쳐지기 때문에, 선명한 이미지를 형성하는 데 필요한 간섭 패턴이 매우 희미해져 가시성이 약 6%에 불과했다. 세포 구조는 보였지만, 시스템은 여러 이미지를 함께 평균화하지 않고서는 이 밀집된 영역에서 미세한 세부 사항을 분해하는 데 어려움을 겪었다. 이 발견은 기술의 경계를 정의한다는 점에서 매우 중요하다. 즉, 이 기술은 특정 신경 세포로 칼슘이 들어오는 지점과 같이 희소하고 밝은 신호에는 매우 잘 작동하지만, 조직 전체가 밀집되어 표지된 경우에는 어려움이 있다는 것이다.

이 연구는 모든 유형의 뇌 신호를 즉각적으로 영상화하는 문제를 해결했다고 주장하지 않는다. 연구진은 이번 연구에서 실제 칼슘 과도 현상(calcium transients)이나 신경전달물질 방출을 측정하지 않았음을 명시적으로 밝혔으며, 대신 향후 연구들이 수행할 방법론적 토대를 마련했다. 그들은 이 시스템이 매우 낮은 빛 수준에서도 작동하여 프레임당 불과 10밀리초 만에 이미지를 포착할 수 있음을 입증했는데, 이는 급격한 생물학적 사건을 포착하기에 충분히 빠른 속도이다. 또한, 다양한 깊이에서 시스템이 어떻게 초점을 맞추는지 예측하는 수학적 모델이 정확함을 확인했으며, 이미지가 자연스럽게 날카로운 점으로 수렴하는 특정 평면을 식별함으로써 물리적 센서 없이도 컴퓨터가 정확히 어디에 초점을 맞춰야 할지 알 수 있도록 했다.

이 연구의 궁극적인 목표는 자극 전극을 완벽하게 고정된 상태로 유지하면서 살아있는 뇌 조직 내에서 뉴런이 어떻게 소통하는지를 연구할 수 있게 하는 것이다. 검출 렌즈를 움직여야 하는 필요성을 제거함으로써, 이 시스템은 전기적 자극과 약물 전달을 고속 3차원 영상 촬영과 결합할 수 있는 실험의 문을 열어준다. 현재의 결과는 밀집된 세포들이 겹치는 빛 신호로 인해 어려움을 준다는 것을 보여주지만, 특정 신경 사건의 특징인 희소하고 밝은 신호들에 대해서는 아름답게 작동한다. 이 연구는 움직이는 부품이라는 물리적 제약이 더 이상 뇌의 복잡한 메커니즘이 작동하는 모습을 관찰하는 데 제한을 두지 않는, 새로운 신경과학 관찰 시대의 중요한 진전이다. 이 작업은 샘플과 렌즈를 고정하는 것이 이론적인 가능성일 뿐만 아니라, 관찰 대상이 되는 신호가 배경 소음으로부터 충분히 구별될 수 있다면 실질적인 현실임을 확인시켜 준다.