Incoherent Holographic Lattice Light-Sheet Microscopy for Low-Signal Volumetric Imaging

Om de uitdaging te begrijpen waar de moderne neurowetenschap voor staat, moet men eerst de delicate taak voorstellen van het observeren van een levend brein in drie dimensies. Wetenschappers proberen al lang te observeren hoe signalen tussen zenuwcellen reizen, een proces dat vaak gepaard gaat met kleine uitbarstingen van calcium of de afgifte van chemische boodschappers. Om deze gebeurtenissen duidelijk te zien, gebruiken onderzoekers een techniek genaamd lichtveldmicroscopie (light-sheet microscopy), die een dunne plak weefsel verlicht met een vel licht, vergelijkbaar met een mes dat door een brood snijdt om de binnenliggende lagen te onthullen. Deze methode is zacht voor het monster en legt beelden snel vast. Er ontstaat echter een aanzienlijk probleem wanneer wetenschappers andere instrumenten aan het monster willen bevestigen, zoals elektroden om de cellen te stimuleren of buisjes om medicijnen toe te dienen. In traditionele opstellingen moet, om door het gehele volume van het weefsel te scannen, ofwel het monster zelf door het licht worden bewogen, of de microscooplens moet op en neer bewegen. Als het monster wordt vastgezet door draden of buisjes, is beweging onmogelijk, en het bewegen van de zware lens kan de delicate verbindingen of de positie van de aangehechte instrumenten verstoren. Dit mechanische conflict heeft de mogelijkheid beperkt om snelle, driedimensionale signalering te bestuderen in experimenten die vaste apparatuur vereisen.

Een team van onderzoekers aan de University of Illinois Chicago, samen met collega's van de University of South Florida en Northern Arizona University, heeft een nieuwe manier ontwikkeld om dit probleem op te lossen. Ze hebben een microscoopsysteem gecreëerd dat zowel het monster als de hoofdlens perfect stilhoudt terwijl er nog steeds een volledig 3D-beeld wordt vastgelegd. In plaats van bewegende onderdelen om op verschillende dieptes te focussen, gebruikt hun systeem een speciale optische truc genaamd incoherente holografie. In deze aanpak wordt het licht dat door de cellen wordt uitgezonden op een manier vastgelegd die informatie over de diepte behoudt, waardoor een computer het beeld achteraf wiskundig op elk vlak binnen het weefsel kan herfocussen. Door deze holografische detectie te combineren met een lattice light-sheet verlichting, hebben ze een apparaat gebouwd waarbij alleen een kleine spiegel in de microscoop beweegt om het lichtveld over het monster te vegen. De detectielens beweegt nooit, wat betekent dat eventuele elektroden of buisjes die aan het monster zijn bevestigd, stabiel en ongestoord blijven.

De onderzoekers testten dit nieuwe systeem, dat ze incoherent holografische lattice light-sheet microscopie noemen, met twee soorten experimenten. Eerst gebruikten ze piepkleine, fluorescerende plastic kraaltjes die kleiner zijn dan een enkele cel om te zien hoe scherp de beelden waren. Ze vonden dat het systeem deze kraaltjes kon oplossen met een helderheid die vergelijkbaar is met die van de beste conventionele microscopen, zelfs zonder complexe software te gebruiken om het beeld op te schonen. De kraaltjes verschenen als duidelijke punten met een breedte van ongeveer 0,33, wat bewijst dat de holografische methode geen beeldkwaliteit opoffert voor het doel om de lens stil te houden. Ze volgden ook de positie van deze kraaltjes in de loop van de tijd en observeerden ze gedurende meerdere minuten om er zeker van te zijn dat het systeem signalen kon volgen zonder de controle te verliezen. De metingen toonden aan dat het systeem de locatie en helderheid van deze punten betrouwbaar kon detecteren, met een stabiliteit die suggereert dat het klaar is voor complexere biologische taken.

Vervolgens ging het team over naar levende cellen, specifelijk een type motorneuron-achtige cellijn die gelabeld is met een groene kleurstof om hun interne structuren te benadrukken. In deze dichte monsters, waar duizenden lichtgevende punten dicht op elkaar gepakt zitten, stuitten de onderzoekers op een natuurlijke limiet. Omdat zoveel emittenten overlappen in het holografische record, werden de duidelijke interferentiepatronen die nodig zijn om een scherp beeld te vormen vaag, met een zichtbaarheid van slechts ongeveer zes procent. Hoewel de cellulaire structuren zichtbaar waren, had het systeem moeite om fijne details in deze drukke gebieden te onderscheiden zonder meerdere beelden samen te voegen. Deze bevinding is cruciaal omdat het de grens van de technologie definieert: het werkt uitstekend voor ijle, heldere signalen, zoals de specifieke hotspots waar calcium in een zenuwcel komt, maar het ondervindt problemen wanneer het gehele weefsel dicht is gelabeld.

De studie beweert niet dat het probleem van het direct beelden van elk type hersensignaal is opgelost. De onderzoekers geven expliciet aan dat ze in dit werk geen werkelijke calciumtransiënten of neurotransmitterafgifte hebben gemeten; in plaats daarvan hebben ze de methodologische basis gelegd voor toekomstige studies die dat wel zullen doen. Ze hebben aangetoond dat het systeem kan werken met zeer lage lichtniveaus, waarbij beelden in slechts tien milliseconden per frame worden vastgelegd, wat snel genoeg is om snelle biologische gebeurtenissen te vangen. Ze bevestigden ook dat het wiskundige model dat ze gebruikten om te voorspellen hoe het systeem op verschillende dieptes focust accuraat was, door specifieke vlakken te identificeren waar het beeld van nature inklapt tot een scherp punt, wat de computer helpt precies te weten waar hij moet focussen zonder een fysieke sensor nodig te hebben.

Het uiteindelijke doel van dit werk is om studies mogelijk te maken naar hoe neuronen communiceren in levend hersenweefsel terwijl stimulatie-elektroden perfect stil blijven staan. Door de noodzaak om de detectielens te bewegen weg te nemen, opent het systeem de deur naar experimenten waarbij elektrische stimulatie en medicijnafgifte gecombineerd kunnen worden met driedimensionale beeldvorming met hoge snelheid. Hoewel de huidige resultaten laten zien dat dicht opeengepakte cellen een uitdaging vormen door de overlappende lichtsignalen, presteert het systeem prachtig voor de ijle, heldere signalen die kenmerkend zijn voor specifieke neurale gebeurtenissen. Dit onderzoek vormt een belangrijke stap naar een nieuw tijdperk van neurowetenschappelijke observatie, waarin de fysieke beperkingen van bewegende onderdelen niet langer de mogelijkheid beperken om de complexe machinerie van het brein in actie te zien. Het werk bevestigt dat het vast houden van het monster en de lens niet alleen een theoretische mogelijkheid is, maar een praktische realiteit, mits de signalen die worden geobserveerd duidelijk genoeg zijn om van de achtergrondruis te worden onderscheiden.