Incoherent Holographic Lattice Light-Sheet Microscopy for Low-Signal Volumetric Imaging

Per comprendere la sfida che la neuroscienza moderna deve affrontare, bisogna innanzitutto immaginare il delicato compito di osservare un cervello vivente in tre dimensioni. Gli scienziati cercano da tempo di osservare come i segnali viaggino tra le cellule nervose, un processo che spesso comporta minuscoli impulsi di calcio o il rilascio di messaggeri chimici. Per vedere questi eventi chiaramente, i ricercatori utilizzano una tecnica chiamata microscopia a foglio di luce (light-sheet microscopy), che illumina una sottile fetta di tessuto con un foglio di luce, proprio come un coltello che affetta una pagnotta di pane per rivelarne gli strati interni. Questo metodo è delicato sul campione e cattura le immagini rapidamente. Tuttavia, sorge un problema significativo quando gli scienziati devono collegare altri strumenti al campione, come elettrodi per stimolare le cellule o tubi per somministrare farmaci. Nelle configurazioni tradizionali, per scansionare l'intero volume del tessuto, il campione stesso deve essere spostato attraverso la luce, oppure la lente del microscopio deve muoversi su e giù. Se il campione è fissato da fili o tubi, muoverlo diventa impossibile, e muovere la pesante lente può disturbare le delicate connessioni o la posizione degli strumenti collegati. Questo conflitto meccanico ha limitato la capacità di studiare la segnalazione tridimensionale rapida in esperimenti che richiedono apparecchiature fisse.

Un team di ricercatori dell'Università dell'Illinois Chicago, insieme a colleghi dell'Università del South Florida e della Northern Arizona University, ha sviluppato un nuovo modo per risolvere questo problema. Hanno creato un sistema microscopico che mantiene sia il campione che la lente principale perfettamente immobili, pur catturando una visione completa in 3D. Inveve di muovere le parti per mettere a fuoco diverse profondità, il loro sistema utilizza un trucco ottico speciale chiamato olografia incoerente. In questo approccio, la luce emessa dalle cellule viene registrata in un modo che preserva le informazioni sulla sua profondità, permettendo a un computer di rinfocalizzare matematicamente l'immagine su qualsiasi piano all'interno del tessuto dopo che la foto è stata scattata. Combinando questo rilevamento olografico con l'illuminazione a foglio di luce reticolare (lattice light-sheet), hanno costruito un dispositivo in cui solo un piccolo specchio all'interno del microscopio si muove per far scorrere il foglio di luce attraverso il campione. La lente di rilevamento non si muove mai, il che significa che qualsiasi elettrodo o tubo collegato al campione rimane stabile e indisturbato.

I ricercatori hanno testato questo nuovo sistema, che chiamano microscopia a foglio di luce reticolare olografica incoerente, utilizzando due tipi di esperimenti. Per prima cosa, hanno utilizzato minuscole sfere di plastica fluorescenti, più piccole di una singola cellula, per vedere quanto fossero nitose le immagini. Hanno scoperto che il sistema poteva risolvere queste sfere con una chiarezza paragonabile ai migliori microscopi convenzionali, anche senza utilizzare software complessi per pulire l'immagine. Le sfere apparivano come punti distinti con una larghezza di circa 0,33, dimostrando che il metodo olografico non sacrifica la qualità dell'immagine in nome del mantenimento della lente ferma. Hanno anche tracciato la posizione di queste sfere nel tempo, osservandole per diversi minuti per garantire che il sistema potesse seguire i segnali senza perdere la traccia. Le misurazioni hanno mostrato che il sistema poteva rilevare in modo affidabile la posizione e la luminosità di questi punti, con una stabilità che suggerisce che sia pronto per compiti biologici più complessi.

Successivamente, il team è passato alle cellule viventi, nello specifico un tipo di linea cellulare simile ai motoneuroni, etichettata con un colorante verde per evidenziare le loro strutture interne. In questi campioni densi, dove migliaia di emettitori sono impacchettati strettamente, i ricercatori hanno incontrato un limite naturale. Poiché così tanti emettitori si sovrappongono nella registrazione olografica, i chiari schemi di interferenza necessari per formare un'immagine nitida sono diventati deboli, con una visibilità di circa il sei per cento. Sebbene le strutture cellulari fossero visibili, il sistema faticava a risolvere i dettagli fini in queste aree affollate senza mediare più immagini insieme. Questa scoperta è cruciale perché definisce il confine della tecnologia: funziona eccezionalmente bene per segnali sparsi e luminosi, come i punti caldi specifici in cui il calcio entra in una cella nervosa, ma affronta sfide quando l'intero tessuto è densamente marcato.

Lo studio non sostiene di aver risolto immediatamente il problema della visualizzazione di ogni tipo di segnale cerebrale. I ricercatori dichiarano esplicitamente di non aver misurato reali transienti di calcio o il rilascio di neurotrasmettitori in questo lavoro; invece, hanno gettato le basi metodologiche per studi futuri che lo faranno. Hanno dimostrato che il sistema può operare con livelli di luce molto bassi, catturando immagini in appena dieci millisecondi per fotogramma, il che è sufficientemente veloce per catturare eventi biologici rapidi. Hanno anche confermato che il modello matematico utilizzato per prevedere come il sistema mette a fuoco a diverse profondità era accurato, identificando piani specifici in cui l'immagine si concentra naturalmente in un punto nitido, il che aiuta il computer a sapere esattamente dove mettere a fuoco senza la necessità di un sensore fisico.

L'obiettivo finale di questo lavoro è consentire studi su come i neuroni comunicano nel tessuto cerebrale vivente mantenendo gli elettrodi di stimolazione perfettamente fermi. Rimuovendo la necessità di muovere la lente di rilevamento, il sistema apre la porta a esperimenti in cui la stimolazione elettrica e la somministrazione di farmaci possono essere combinate con l'imaging tridimensionale ad alta velocità. Sebbene i risultati attuali mostrino che le cellule densamente impacchettate presentano una sfida a causa della sovrapposizione dei segnali luminosi, il sistema funziona magnificamente per i segnali sparsi e luminosi che sono caratteristici di specifici eventi neurali. Questa ricerca rappresenta un passo significativo verso una nuova era di osservazione della neuroscienza, in cui i vincoli fisici delle parti mobili non limitano più la capacità di osservare il complesso meccanismo del cervello in azione. Il lavoro conferma che mantenere il campione e la lente fissi non è solo una possibilità teorica, ma una realtà pratica, a condizione che i segnali osservati siano abbastanza distinti da poter essere separati dal rumore di fondo.