Incoherent Holographic Lattice Light-Sheet Microscopy for Low-Signal Volumetric Imaging

現代の神経科学が直面している課題を理解するには、まず、生きた脳を三次元的に観察するという繊細な作業を想像しなければならない。科学者たちは、神経細胞間で信号がどのように伝わるかを観察することを長年試みてきた。そのプロセスには、しばしば微小なカルシウムの放出や化学伝達物質の放出が関わっている。これらの現象を鮮明に捉えるために、研究者たちはライトシート顕微鏡と呼ばれる技術を使用している。これは、パンの層を内部に露出させるためにナイフでスライスするように、組織の薄い断面を光のシートで照らす手法である。この方法は試料に対して優しく、画像を素早くキャプチャすることができる。しかし、科学者が細胞を刺激するための電極や、薬物を注入するためのチューブといった他のツールを試料に取り付ける必要がある場合、重大な問題が生じる。従来のセットアップでは、組織の全容積をスキャンするために、試料自体を光の中へ移動させるか、あるいは顕微鏡のレンズを上下に動かさなければならない。もし試料がワイヤーやチューブによって固定されている場合、移動させることは不可能であり、また重いレンズを動かすことは、取り付けられた道具の位置や繊細な接続を乱してしまう可能性がある。この機械的な衝突が、固定された装置を必要とする実験において、迅速な三次元的シグナリングの研究能力を制限してきた。

イリノイ大学シカゴ校の研究チームは、サウスフロリダ大学および北アリゾナ大学の共同研究者と共に、この問題を解決する新しい方法を開発した。彼らは、試料とメインレンズの両方を完全に静止させたまま、完全な3Dビューをキャプチャできる顕微鏡システムを作り上げた。異なる深さに焦点を合わせるために部品を動かす代わりに、彼らのシステムは「非干渉ホログラフィー（incoherent holography）」と呼ばれる特別な光学トリックを使用している。この手法では、細胞から放出される光が、その深さに関する情報を保持するように記録され、画像が撮影された後にコンピュータによって画像内の任意の平面へと数学的に再フォーカスさせることができる。このホログラフィック検出を格子状ライトシート照射（lattice light-sheet illumination）と組み合わせることで、彼らは顕微鏡内部の小さな鏡だけが動き、光のシートを試料に対して掃引（スウィープ）するデバイスを構築した。検出レンズは決して動かないため、試料に取り付けられた電極やチューブは安定し、乱されることもない。

研究者たちは、この新しいシステム（彼らはこれを「非干渉ホログラフィック格子状ライトシート顕微鏡」と呼んでいる）を、2種類の実験を用いてテストした。まず、単一の細胞よりも小さい蛍光プラスチックビーズを用い、画像の鮮明さがどの程度であるかを確認した。その結果、このシステムは、複雑なソフトウェアによる画像のクリーニングを行わずとも、最高の従来の顕微鏡に匹敵する明瞭さでこれらのビーズを解像できることが判明した。ビーズは約0.33の幅を持つ明確な点として現れ、これはホログラフィック法がレンズを静止させるために画質を犠牲にしていないことを証明している。彼らはまた、これらのビーズの位置を時間の経過とともに追跡し、数分間にわたって観察することで、信号を見失うことなく追跡できることを確認した。測定の結果、このシステムはこれらの点の位置と明るさを確実に検出でき、その安定性は、より複雑な生物学的タスクへの準備ができていることを示唆している。

次に、チームは生きた細胞、具体的には内部構造を強調するために緑色の染料でラベル付けされた運動ニューロン様細胞株へと進んだ。数千もの発光点が密集しているこれらの高密度な試料において、研究者たちは自然な限界に直面した。非常に多くのエミッター（発光体）がホログラフィック記録の中で重なり合うため、鮮明な画像を形成するために必要な干渉パターンが希薄になり、可視性はわずか約6パーセントにとどまった。細胞構造は確認できたものの、システムは複数の画像を平均化することなしには、これらの混み合った領域における微細な詳細を解像することに苦慮した。この発見は極めて重要である。なぜなら、この技術の境界線を定義しているからである。つまり、特定の神経細胞へのカルシウム流入のような、疎で明るい信号には非常にうまく機能するが、組織全体が高密度にラベル付けされている場合には課題に直面するということである。

この研究は、あらゆるタイプの脳信号のイメージング問題を即座に解決したと主張しているわけではない。研究者たちは、今回の研究では実際のカルシウム一過性現象や神経伝達物質の放出を測定していないことを明示している。代わりに、それらを行う将来の研究のための方法論的な基礎を築いたのである。彼らは、このシステムが非常に低い光レベルでも動作し、わずか10ミリ秒のフレームで画像をキャプチャできることを実証した。これは、急速な生物学的イベントを捉えるのに十分な速さである。また、異なる深さでシステムがどのように焦点を合わせるかを予測するために使用した数学的モデルが正確であることを確認し、画像が自然に鋭い点へと収束する特定の平面を特定した。これにより、物理的なセンサーを必要とせずに、コンピュータが正確にどこに焦点を合わせるべきかを知ることができるようになる。

この研究の究極の目標は、刺激電極を完全に静止させた状態で、生きた脳組織内でのニューロンのコミュニケーションを研究できるようにすることである。検出レンズを動かす必要性を排除することで、このシステムは、電気刺激と薬物投与を高速な三次元イメージングと組み合わせることができる実験への扉を開く。現在の結果は、密集した細胞が重なり合う光信号による課題を提示しているものの、システムは特定の神経イベントに特徴的な、疎で明るい信号に対しては見事に機能する。この研究は、動く部品という物理的な制約によって、脳の複雑な機構の動きを観察する能力が制限されない、新しい時代の神経科学観察への重要な一歩を象徴している。この研究は、試料とレンズを固定しておくことが、単なる理論的な可能性ではなく、観察対象となる信号が背景ノイズから分離できるほど十分に明確であれば、実用的な現実であることを裏付けている。