Incoherent Holographic Lattice Light-Sheet Microscopy for Low-Signal Volumetric Imaging

Um die Herausforderung zu verstehen, vor der die moderne Neurowissenschaft steht, muss man sich zunächst die delikate Aufgabe vorstellen, ein lebendes Gehirn in drei Dimensionen zu beobachten. Wissenschaftler versuchen seit langem zu beobachten, wie Signale zwischen Nervenzellen reisen, ein Prozess, der oft winzige Kalziumausbrüche oder die Freisetzung chemischer Botenstoffe beinhaltet. Um diese Ereignisse deutlich zu sehen, nutzen Forscher eine Technik namens Lichtblattmikroskopie, die einen dünnen Gewebeschnitt mit einem Lichtblatt beleuchtet, ganz ähnlich wie ein Messer, das durch einen Laib Brot schneidet, um die inneren Schichten zu enthüllen. Diese Methode ist schonend für die Probe und erfasst Bilder schnell. Ein erhebliches Problem entsteht jedoch, wenn Wissenschaftler andere Werkzeuge an die Probe anbringen müssen, wie etwa Elektroden zur Stimulation der Zellen oder Röhren zur Verabreichung von Medikamenten. In herkömmlichen Aufbauten muss entweder die Probe selbst durch das Licht bewegt werden oder die Mikroskoplinse muss auf und ab bewegt werden, um das gesamte Volumen des Gewebes abzutasten. Wenn die Probe durch Drähte oder Röhren fixiert ist, wird ihre Bewegung unmöglich, und die Bewegung der schweren Linse kann die empfindlichen Verbindungen oder die Position der angehängten Werkzeuge stören. Dieser mechanische Konflikt hat die Fähigkeit eingeschränkt, schnelle, dreidimensionale Signalprozesse in Experimenten zu untersuchen, die eine feste Ausrüstung erfordern.

Ein Team von Forschern der University of Illinois Chicago, zusammen mit Kollegen der University of South Florida und der Northern Arizona University, hat einen neuen Weg entwickelt, um dieses Problem zu lösen. Sie haben ein Mikroskopsystem entwickelt, das sowohl die Probe als auch die Hauptlinse vollkommen still hält und dennoch eine vollständige 3D-Ansicht erfasst. Anstatt bewegliche Teile zu verwenden, um auf verschiedene Tiefen zu fokussieren, nutzt ihr System einen speziellen optischen Trick namens inkohärente Holographie. Bei diesem Ansatz wird das von den Zellen emittierte Licht auf eine Weise aufgezeichnet, die Informationen über dessen Tiefe bewahrt, sodass ein Computer das Bild nach der Aufnahme mathematisch auf jede Ebene innerhalb des Gewebes neu fokussieren kann. Durch die Kombination dieser holographischen Detektion mit einer Gitter-Lichtblatt-Beleuchtung (Lattice Light-Sheet) haben sie ein Gerät gebaut, bei dem sich nur ein kleiner Spiegel innerhalb des Mikroskops bewegt, um das Lichtblatt über die Probe zu führen. Die Detektionslinse bewegt sich nie, was bedeutet, dass alle an die Probe angehängten Elektroden oder Röhren stabil und ungestört bleiben.

Die Forscher testeten dieses neue System, das sie inkohärente holographische Gitter-Lichtblatt-Mikroskopie nennen, anhand zweier Arten von Experimenten. Zuerst verwendeten sie winzige, fluoreszierende Kunststoffkügelchen, die kleiner als eine einzelne Zelle sind, um zu sehen, wie scharf die Bilder waren. Sie fanden heraus, dass das System diese Kügelchen mit einer Klarheit auflösen konnte, die mit der besten konventionellen Mikroskope vergleichbar ist, selbst ohne die Verwendung komplexer Software zur Bildbereinigung. Die Kügelchen erschienen als deutliche Punkte mit einer Breite von etwa 0,33, was beweist, dass die holographische Methode die Bildqualität nicht zugunsten des stationären Linsenstatus opfert. Sie verfolgten auch die Position dieser Kügelchen über die Zeit und beobachteten sie mehrere Minuten lang, um sicherzustellen, dass das System Signale verfolgen kann, ohne den Anschluss zu verlieren. Die Messungen zeigten, dass das System die Position und Helligkeit dieser Punkte zuverlässig erfassen konnte, mit einer Stabilität, die darauf hindeutet, dass es für komplexere biologische Aufgaben bereit ist.

Als Nächstes ging das Team zu lebenden Zellen über, speziell zu einer Art von motorneuron-ähnlicher Zelllinie, die mit einem grünen Farbstoff markiert wurde, um ihre internen Strukturen hervorzuheben. In diesen dichten Proben, in denen tausende lichtemittierende Punkte eng beieinander liegen, stießen die Forscher auf eine natürliche Grenze. Da so viele Emitter im holographischen Datensatz überlappen, wurden die klaren Interferenzmuster, die zur Bildung eines scharfen Bildes nötig sind, schwach, mit einer Sichtbarkeit von nur etwa sechs Prozent. Während die zellulären Strukturen sichtbar waren, hatte das System Schwierigkeiten, feine Details in diesen dicht gedrängten Bereichen aufzulösen, ohne mehrere Bilder miteinander zu mitteln. Dieser Befund ist entscheidend, da er die Grenze dieser Technologie definiert: Das System funktioniert hervorragend für spärliche, helle Signale, wie etwa die spezifischen Hotspots, an denen Kalzium in eine Nervenzelle eintritt, stößt aber an seine Grenzen, wenn das gesamte Gewebe dicht markiert ist.

Die Studie beansprucht nicht, das Problem der Bildgebung jedes Typs von Hirnsignalen sofort gelöst zu haben. Die Forscher geben ausdrücklich an, dass sie in dieser Arbeit keine tatsächlichen Kalziumtransienten oder die Freisetzung von Neurotransmittern gemessen haben; stattdessen haben sie das methodische Fundament für zukünftige Studien gelegt, die dies tun werden. Sie zeigten, dass das System mit sehr niedrigen Lichtpegeln arbeiten kann und Bilder in nur zehn Millisekunden pro Frame erfasst, was schnell genug ist, um rasante biologische Ereignisse einzufangen. Sie bestätigten auch, dass das mathematische Modell, das sie zur Vorhersage der Fokussierung in verschiedenen Tiefen verwendeten, genau war, indem sie spezifische Ebenen identifizierten, in denen das Bild natürlich in einen scharfen Punkt kollabiert, was dem Computer hilft, genau zu wissen, wo er fokussieren muss, ohne einen physischen Sensor zu benötigen.

Das ultimative Ziel dieser Arbeit ist es, Studien darüber zu ermöglichen, wie Neuronen in lebendem Hirngewebe kommunizieren, während die Stimulationselektroden vollkommen ruhig bleiben. Durch die Beseitigung der Notwendigkeit, die Detektionslinse zu bewegen, öffnet das System die Tür für Experimente, bei denen elektrische Stimulation und Medikamentenverabreichung mit hochgeschwindigkeits-dreidimensionaler Bildgebung kombiniert werden können. Während die aktuellen Ergebnisse zeigen, dass dicht gepackte Zellen aufgrund der überlappenden Lichtsignale eine Herausforderung darstellen, arbeitet das System wunderbar für die spärlichen, hellen Signale, die charakteristisch für spezifische neuronale Ereignisse sind. Diese Forschung stellt einen bedeutenden Schritt in Richtung einer neuen Ära der neurowissenschaftlichen Beobachtung dar, in der die physikalischen Einschränkungen beweglicher Teile die Fähigkeit, das komplexe Zusammenspiel des Gehirns in Aktion zu beobachten, nicht mehr begrenzen. Die Arbeit bestätigt, dass das Halten von Probe und Linse nicht nur eine theoretische Möglichkeit, sondern eine praktische Realität ist, vorausgesetzt, die beobachteten Signale sind deutlich genug, um vom Hintergrundrauschen unterschieden werden zu können.