H18 haemagglutinin binds MHC class II at a site distant from the canonical sialic-acid binding site

技術要約：H18 ヘマグルチニンは、標準的なシアル酸結合部位から離れた部位で MHC クラス II に結合する

問題提起
典型的なインフルエンザA型ウイルス（IAV）は、細胞への侵入のためにヘマグルチニン（HA）を利用してシアル酸で修飾された糖鎖に結合するが、このメカニズムがウイルスの向性と宿主範囲を決定している。しかし、コウモリ由来の IAV サブタイプ（H17N10、H18N11、H18N12）および最近発見された鳥由来の H19 は、糖鎖の代わりに主要組織適合遺伝子複合体クラス II（MHC-II）分子を受容体として利用する。これまでの研究により、H18 HA が MHC-II を介して細胞侵入を媒介することが確立されているが、その相互作用の分子基盤は未定義のままであった。タンパク質受容体に結合するために、融合機構を損なうことなく HA がどのように構造的に適応するかを理解することは、これらコウモリ由来 IAV のウイルス進化の解明および宿主範囲の適応能を評価する上で極めて重要である。

方法論
著者らは、構造生物学、生物物理学、およびウイルス学を組み合わせた多角的なアプローチを用いて、H18 と HLA-DR の相互作用を特性評価した。

• 構造マッピング： クライオ電子顕微鏡（cryoEM）を用いて H18:HLA-DR 複合体を可視化し、当該複合体の 3.4 Å 再構成およびアポ状態 H18 の 2.3 Å マップを得た。水素・重水素交換質量分析法（HDX-MS）を用い、結合に伴う溶媒交換の減少を特定することで、H18 ヘドドメインおよび HLA-DR 分子の両方の相互作用界面をマッピングした。
• 生物物理学的特性評価： バイオレイヤー干渉法（BLI）を用いて、組換え H18（三量体エクトドメインおよび単離されたヘドメイン）と可溶性 HLA-DR または HLA-DM との間の結合親和性およびキネティクスを測定した。
• 細胞およびウイルス学的アッセイ： 特定の部位のアラニン置換変異体を生成し、同定された残基の機能的重要性を検証した。これらの変異体について、表面発現、pH 誘発性シンシチウム形成（膜融合）、および HLA-DR を発現する MDCK 細胞におけるウイルス増殖キネティクスを評価した。
• 進化解析： 特定の変異体を HLA-DR 発現細胞上で継代培養し、代償的な進化の変化を観察した。

主な結果

1. 新規結合部位の特定： 本研究は、標準的なシアル酸結合ポケットとは異なる、H18 HA1 ヘドメイン上の特定の結合界面を特定した。この部位は R サブドメイン内に位置し、E サブドメインとの境界付近（残基 S171 を中心とし、ループ H167–P175、Y256–Q263、N114–K120、および T81–Y86 を含む）に存在する。この部位の中心は、標準的な受容体結合部位から約 30 Å 離れている。
2. 結合親和性と特異性： H18 はヒト MHC-II 分子である HLA-DR に対してマイクロモル単位の親和性（見かけの $K_d \approx 12\text{--}26\ \mu\text{M}$）で結合する。結合は HLA-DR に特異的であり、HLA-DM への結合は無視できる程度である（$>300\ \mu\text{M}$）。この相互作用はシアル酸を必要とせず、脱糖鎖処理された HLA-DR も同等またはわずかに高い親和性で H18 に結合する。
3. MHC-II 結合による融合のプライミング： HDX-MS 解析により、HLA-DR の結合が H18 の融合機構に構造変化を誘導することが明らかになった。具体的には、結合によって、融合ペプチド付近の HA2 ステム領域および HA1 三量体界面におけるダイナミクスが増加（HDX が増加）し、30 ループおよび膜近傍のヘリックスにおけるダイナミクスが減少（あるいは増加）した。これらの変化は、受容体結合が融合のトリガーではない標準的な HA とは異なり、受容体との結合が HA を「プライミング（準備状態に）」させるメカニズムを示唆している。
4. 機能的検証： 特定された結合部位の変異（例：H167A、P175A、Y256A、Y258A、K262A）は、シンシチウム形成を著しく阻害し、ウイルス感染力を約 1,000 倍減少させた。
5. 代償的進化： H167A 変異体を継代培養した結果、代償的な変異である S267N が出現した。この変異は、結合界面付近の N-結合型糖鎖部位（N265）を消失させるものである。この糖鎖の除去により結合部位へのアクセシビリティが高まり、結合親和性とウイルスのフィットネスが回復した。これは、受容体への結合が、界面の残基を直接変えるだけでなく、界面周囲の糖鎖環境を再構築することによって最適化され得ることを示している。

意義
本論文は、H18 HA と MHC-II の分子界面を確立し、HA スキャフォールドがコアとなる融合構造を維持しつつ、タンパク質受容体と結合するための実質的な構造的可塑性を備えていることを明らかにしている。本知見は以下の点を強調している：

• コウモリ由来 IAV における糖鎖からタンパク質受容体への受容体利用の切り替えは、標準的な受容体ポケットから遠く離れた独自の結合部位を伴う。
• H18 による受容体への結合は、単なる付着イベントではなく、融合機構を能動的にプライミングしており、付着を融合トリガーへと直接結びつけている。
• 受容体結合部位付近の糖鎖は、立体障害として機能する場合があり、その消失が受容体結合を促進させることがあり、これは進化的な適応メカニズムを提供している。
• この特定の MHC-II 結合領域における配列変異を監視することは、コウモリ由来インフルエンザウイルスの宿主範囲と適応能を評価する上で不可欠である。

著者らは、これらの知見が、ウイルス融合タンパク質がいかにして根本的に異なる様式の受容体結合へと進化できるかについての構造的・機能的な記述を提供し、種を超えた伝播障壁を克服するためのインフルエンザウイルスの適応力を浮き彫りにしていると結論付けている。