Distinct phenotypic and transcriptomic profiles of myeloid-derived suppressor cells induced by 4T1 tumor growth and cyclophosphamide treatment

기술 요약: 4T1 종양 성장 및 시클로포스파미드에 의해 유도된 MDSC의 구별되는 표현형 및 전사체 프로필

문제 제식
골수 유래 억제 세포(MDSC)는 암이나 만성 염증과 같은 병리적 조건 하에서 확장되거나, 시클로포스파미드(CTX)와 같은 약물에 의해 약리학적으로 유도될 수 있는 미성숙 골수 세포의 이질적인 집단이다. MDSC는 아르기나아제, 일산화질소(NO), 활성산소종(ROS), 사이토카인 등을 포함하는 기전을 통해 면역 억제를 매개하는 것으로 알려져 있으나, 종양 성장에 의해 생성된 MDSC와 CTX 처리에 의해 유도된 MDSC가 표현형 및 분자적으로 구별되는 집단인지 여부는 여전히 불분명하다. 선행 연구들은 종양 유래 신호가 흔히 ROS 의존적 활성을 가진 과립구형 MDSC(PMN-MDSC)를 선호하는 반면, CTX에 의한 골수 손상 및 이후의 회복은 NO 의존적 활성을 가진 단핵구형 MDSC(M-MDSC)를 선호할 수 있음을 시사한다. 그러나 이들의 하위 집단 구성, 억제 매개체 프로필 및 전사체 경관을 직접 비교한 연구는 부족했다.

연구 방법론
본 연구는 네 가지 조건(대조군, 4T1 종양 보유(종양), CTX 처리(CTX), 그리고 종양 보유 및 CTX 병용 처리(종양 + CTX)) 하에서 골수 MDSC를 비교하기 위해 암컷 BALB/c 마우스를 이용한 모델을 활용하였다.

• 유도 모델: 4T1-Luc 세포를 유방 지방 패드에 접종하여 종양 성장을 유도하였다. CTX(150 mg/kg)는 단독 또는 종양 접종 후 일정에 따라 복강 내로 투여되었다.
• 세포 분리: 골수 세포를 채취한 후, 자기 비드 분리법을 사용하여 CD11b⁺Gr-1⁺ MDSC를 분리하였다.
• 표현형 분석: 유세포 분석법을 사용하여 총 MDSC를 정량화하고 하위 집단(PMN-MDSC: CD11b⁺Ly6G⁺Ly6Clow, M-MDSC: CD11b⁺Ly6G⁻Ly6Chi)을 구분하였다.
• 기능적 분석: 세포 내 ROS 수준은 DCFH-DA 형광을 사용하여 측정하였고, NO 생성은 DAF-FM DA 형광을 통해 평가하였으며, 아르기나아제 활성은 효소법으로 정량화하였다.
• 분자 프로파일링: 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 통해 주요 MDSC 관련 유전자(Cybb, Nos2, Arg1, Cxcr2, Tgfb1, Cd84 등)의 발현을 분석하였다.
• 전사체 분석: 네 그룹의 MDSC(그룹당 n=4)에 대해 벌크 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 수행하였다. 데이터 분석에는 차등 발현 분석(DESpy2), 주성분 분석(PCA), 계층적 클러스터링, 경로 농축 분석(KEGG 및 Gene Ontology)이 포함되었다.

주요 결과

1. 하위 집단 구성: 세 가지 유도 조건 모두 골수 MDSC의 절대 수와 빈도를 유의하게 증가시켰다. 그러나 하위 집단 구성은 달랐다:

   • 종양 성장은 PMN-MDSC를 우선적으로 확장시켰다.
   • CTX 처리 및 종양 + CTX 조합은 M-MDSC를 우선적으로 확장시켰다.
   • 총 백혈구 수는 종양 보유 그룹에서는 증가했으나 CTX 단독 그룹에서는 증가하지 않았으며, 이는 서로 다른 기저 메커니즘(종양 유도 골수 형성 vs. 보상적 조혈 회복)을 시사한다.

2. 억제 매개체 프로필:

   • ROS: 종양 유도 MDSC는 다른 그룹에 비해 Cybb의 발현이 증가하고 수치적으로 높은 ROS 관련 형광을 나타냈다.
   • NO: CTX를 포함한 그룹(CTX 및 종양 + CTX)은 qRT-PCR에서 Nos2 mRNA 수준의 제한적인 변화에도 불구하고 증가된 NO 관련 형광을 보였는데, 이는 잠재적인 전사 후 조절을 시사한다.
   • 아르기나아제: 종양 및 CTX 그룹에서 Arg1 발현은 대조군에 비해 감소하였으며, 그룹 간 총 아르기나아제 활성에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

3. 유전자 발현 및 전사체 분석:

   • qRT-PCR: 종양 + CTX 그룹은 다른 그룹들과 구별되게 Cd84와 Tgfb1의 선택적 상향 조절을 보였다.
   • RNA-seq: PCA 및 계층적 클러스터링은 네 그룹을 명확하게 분리하였으며, 이는 각 조건에 따른 고유한 전사 프로그램을 나타낸다.
   • 차등 발현 유전자(DEGs): 종양 그룹이 가장 많은 수의 DEGs(2,283개)를 가졌으며, CTX(1,438개), 종양 + CTX(812개) 순이었다.
   • 경로 농축:
     • 종양: JAK-STAT 신호 전달, 에페로사이토시스(efferocytosis), 콜레스테롤 대사가 농축되었다.
     • CTX: 판코니 빈혈 경로, 상동 재조합, 세포 주기 경로가 농축되었다(DNA 손상 반응 및 회복을 반영함).
     • 종양 + CTX: JAK-STAT 신호 전달, 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용, 보체/응고 폭포가 농축되었다.

의의 및 주장
저자들은 종양 성장, CTX 처리 및 그 조합이 동일한 표면 마커(CD11b⁺Gr-1⁺)를 공유함에도 불구하고 표현형 및 전사적으로 구별되는 MDSC 집단을 생성한다고 결론지었다.

• 구별되는 메커니즘: 본 연구는 유도 방법이 계통 편향(PMN vs. M-MDSC), 주요 억제 매개체(ROS vs. NO), 그리고 근본적인 전사 프로그램을 결정한다는 것을 입증한다.
• 맥락 의존성: 이러한 결과는 MDSC가 균일한 실체가 아님을 강조한다. 즉, 생물학적 특성은 특정 환경 신호(종양 유래 염증 vs. 화학요법 유도 스트레스)에 의해 형성된다.
• 연구에 대한 시사점: 본 논문은 서로 다른 실험 프로토콜에 의해 유도된 MDSC를 상호 교환 가능한 것으로 간주해서는 안 된다고 주장한다. 연구자들은 종양 면역 연구를 위해 모델을 선택하거나, 치료 유도 면역 조절을 평가할 때, 혹은 MDSC 생물학을 해석할 때 유도 맥락을 신중하게 고려해야 한다. 이 연구는 유도 이력을 고려하지 않고 표면 마커에만 의존하는 것이 중요한 기능적, 분자적 차이를 간과할 수 있음을 강조한다.