Distinct phenotypic and transcriptomic profiles of myeloid-derived suppressor cells induced by 4T1 tumor growth and cyclophosphamide treatment

技術要約：4T1腫瘍成長およびシクロホスファミドによって誘導されるMDSCの異なる表現型およびトランスクリプトーム・プロファイル

問題提起
骨髄由来抑制細胞（MDSC）は、がんや慢性炎症などの病理学的条件下で拡大する、未熟な骨髄系細胞の不均一な集団であるが、シクロホスファミド（CTX）のような薬剤によっても薬理学的に誘導される。MDSCは、アルギナーゼ、一酸化窒素（NO）、活性酸素種（ROS）、およびサイトカインを介したメカニズムを通じて免疫抑制を媒介することが知られているが、腫瘍成長によって生成されたMDSCと、CTX治療によって誘導されたMDSCが、表現型および分子レベルで異なる集団であるかどうかは不明なままである。先行研究では、腫瘍由来のシグナルはしばにROS依存的な活性を持つ多形核MDSC（PMN-MDSC）を優先させる一方で、CTXによる骨髄損傷とその後の回復は、NO依存的な活性を持つ単球系MDSC（M-MDSC）を優先させる可能性が示唆されている。しかし、それらのサブセット組成、抑制性メディエーターのプロファイル、およびトランスクリプトーム・ランドスケープを直接比較した研究は不足していた。

方法論
本研究では、マウスモデル（雌性BALB/cマウス）を用い、コントロール、4T1腫瘍担持（Tumor）、CTX投与（CTX）、および腫瘍担持＋CTX投与（Tumor + CTX）の4つの条件下における骨髄MDSCを比較した。

• 誘導モデル： 4T1-Luc細胞を乳腺脂肪体へ接種して腫瘍成長を誘導した。CTX（150 mg/kg）は、単独または腫瘍接種後のスケジュールに従って、腹腔内に投与された。
• 細胞分離： 磁気分離法を用いて、CD11b⁺Gr-1⁺ MDSCを単離した。
• 表現型解析： フローサイトメトリーを用いて、全MDSCの定量およびサブセット（PMN-MDSCs: CD11b⁺Ly6G⁺Ly6Clow、およびM-MDSCs: CD11b⁺Ly6G⁻Ly6Chi）の判別を行った。
• 機能アッセイ： 細胞内ROSレベルはDCFH-DA蛍光を用いて測定し、NO産生はDAF-FM DA蛍光を用いて評価し、アルギナーゼ活性は酵素的に定量した。
• 分子プロファイリング： 定量的RT-PCR（qRT-PCR）により、主要なMDSC関連遺伝子（Cybb, Nos2, Arg1, Cxcr2, Tgfb1, Cd84など）の発現を解析した。
• トランスクリプトミクス： 全4群のMDSCに対してバルクRNAシーケンシング（RNA-seq）を実施した（各群n=4）。データ解析には、DESeq2による差次的発現解析、主成分分析（PCA）、階層的クラスタリング、およびパスウェイ濃縮解析（KEKGおよびGene Ontology）を用いた。

主な結果

1. サブセット組成： すべての誘導条件において、骨髄MDSCの絶対数および頻度が有意に増加した。しかし、サブセット組成は異なっていた：

   • 腫瘍成長は、PMN-MDSCを優先的に拡大させた。
   • CTX治療およびTumor + CTXの組み合わせは、M-MDSCを優先的に拡大させた。
   • 全白血球数は腫瘍担持群で増加したが、CTX単独群では増加しなかった。これは、異なる基礎的なメカニズム（腫瘍駆動型の骨髄造血 vs 補償的な造血回復）を示唆している。

2. 抑制性メディエーター・プロファイル：

   • ROS： 腫瘍誘導MDSCは、他の群と比較してCybbの発現が増加し、数値的に高いROS関連蛍光を示した。
   • NO： CTXを含む群（CTXおよびTumor + CTX）は、qRT-PCRにおけるNos2 mRNAレベルの限定的な変化にもかかわらず、増加したNO関連蛍光を示した。これは、潜在的な転写後調節を示唆している。
   • アルギナーゼ： Arg1の発現は、コントロールと比較してTumor群およびCTX群で減少しており、全群間で総アルギナーゼ活性に有意な差は見られなかった。

3. 遺伝子発現およびトランスクリプトミクス：

   • qRT-PCR： Tumor + CTX群は、他の群とは異なり、Cd84およびTgfb1の選択的なアップレギュレーションを示した。
   • RNA-seq： PCAおよび階層的クラスタリングにより、4つの群が明確に分離され、各条件に固有のトランスクリプトーム・プログラムが存在することが示された。
   • 差次的発現遺伝子（DEG）： DEGの数は、Tumor群が最も多く（2,283個）、次いでCTX（1,438個）、Tumor + CTX（812個）であった。
   • パスウェイ濃縮：
     • Tumor： JAK-STATシグナル、エフェロサイトーシス（貪食）、およびコレステロール代謝に富んでいた。
     • CTX： ファンコニ貧血経路、相同組換え、および細胞周期経路に富んでいた（DNA損傷応答および回復を反映）。
     • Tumor + CTX： JAK-STATシグナル、サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用、および補体/凝固カスケードに富んでいた。

意義および主張
著者らは、腫瘍成長、CTX治療、およびその組み合わせは、同じ表面マーカー（CD11b⁺Gr-1⁺）を共有しているものの、表現型およびトランスクリプトームの両面で明確に異なるMDSC集団を生成すると結論付けている。

• 異なるメカニズム： 本研究は、誘導方法が系統の偏り（PMN vs M-MDSC）、主要な抑制性メディエーター（ROS vs NO）、および基礎となるトランスクリプトーム・プログラムを決定することを実証している。
• 文脈依存性： これらの知見は、MDSCが均一な実体ではないことを強調している。その生物学的特性は、特定の環境シグナル（腫瘍由来の炎症 vs 化学療法誘発性のストレス）によって形成される。
• 研究への示唆： 本論文は、異なる実験プロトコルによって誘導されたMDSCを、互換性のあるものとして扱うべきではないと主張している。研究者は、腫瘍免疫の研究においてモデルを選択したり、治療誘発性の免疫調節を評価したりする際に、MDSCの生物学を解釈するための誘導コンテキストを慎重に考慮する必要がある。本研究は、表面マーカーのみに依存することは、誘導履歴による重要な機能的・分子的な違いを見落とす可能性があることを浮き彫りにしている。