An integrated pipeline to count individual transcripts with single-cell resolution

داخل كل خلية حية، تجري محادثة معقدة. فالجينات، وهي كتيبات التعليمات المخزنة في الحمض النووي (DNA)، تُقرأ باستمرار لإنتاج جزيئات تسمى الحمض النووي الريبوزي (RNA)، والتي توجه بعد ذلك أنشطة الخلية. وبالنسبة للعلماء، فإن فهم كمية جزيء معين من الـ RNA الموجود في خلية معينة يشبه قراءة حجم المحادثة؛ فهو يكشف عن التعليمات التي يتم اتباعها وتلك التي يتم تجاهلها. وبينما تمكن الباحثون منذ فترة طويلة من قياس متوسط كمية الـ RNA في مجموعة كبيرة من الخلايا، فإن رؤية عدد النسخ الموجودة بالضبط في خلية واحدة فردية داخل كائن حي ظل تحديًا صعبًا. وهذا ينطبق بشكل خاص على الكائنات الدقيقة حيث تكون الخلايا متراصة بإحكام، وللجينات التي تنتج رسائل RNA قصيرة جدًا يصعب الإمساك بها. وبدون هذه الرؤية الدقيقة للخلية الواحدة، غالبًا ما يفتقد العلماء الاختلافات الدقيقة في كيفية سلوك الجينات في أجزاء مختلفة من الجسم، حتى داخل الحيوان نفسه.

لقد طور فريق من الباحثين الآن طريقة جديدة ومبسطة لحل هذه المشكلة باستخدام دودة الأرض المستديرة المجهرية "كاينورابديثيس إيليجانس" (Caenorhabditis elegans). هذه الدودة الصغيرة هي مفضلة لدى علماء الوراثة لأنها شفافة ولها عدد ثابت من الخلايا، حيث يمتلك كل فرد نفس التشريح تمامًا. وقد دمج العلماء تقنية كيميائية قوية تسمى "تفاعل السلسلة الهجين" (Hybridization Chain Reaction) مع برنامج كمبيوتر متخصص لإنشاء مسار يمكنه عد جزيئات RNA الفردية داخل خلايا محددة. ومن خلال تجميد الديدان ومعالجتها بصبغات فلورية، جعلوا جزيئات الـ RNA تتوهج مثل النجوم الصغيرة. ثم استخدموا مجهرًا لالتقاط صور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة وبرامج للبحث التلقائي عن هذه النقاط المتوهجة وعدّها. يعمل هذا النهج مع الديدان في أي مرحلة من مراحل الحياة، من الأجنة إلى البالغين، ويمكنه تتبع جينات متعددة مختلفة في نفس الوقت دون أن تختلط الإشارات ببعضها البعض.

اختبر الباحثون نظامهم الجديد من خلال مراقبة عدة جينات معروفة بنشاطها في أجزاء محددة من الدودة. ففي الأجنة المبكرة، نجحوا في تحديد الجينات التي تعمل فقط في خلايا معينة، مما طابق ما هو معروف بالفعل حول كيفية تطور الدودة. كما نظروا في الديدان البالغة ووجدوا جينات نشطة في الجهاز التكاثري. وتضمن الاختبار الرئيسي جينات تنتج رسائل RNA قصيرة جدما، وهي رسائل يصعب دراستها بشكل ملحوظ باستخدام الطرق القديمة. وقد تمكن مسار العمل الجديد من تصوير هذه الرسائل القصيرة بوضوح، مما أثبت أن الطريقة حساسة بما يكفي لالتقاط حتى أصغر الإشارات الجينية. كما أظهر الفريق أنه يمكنهم مراقبة ثلاثة جينات مختلفة تتوهج بألوان مختلفة داخل نفس الدودة، مما يوضح أن التقنية يمكنها التعامل مع تجارب الجينات المتعددة المعقدة.

ولمعرفة ما إذا كان بإمكان طريقتهم الكشف عن رؤى بيولوجية جديدة، طبق العلماء هذه الطريقة لدراسة كيفية تأثير الطفرات على التعبير الجيني في خلايا عصبية محددة. فقد ركزوا على جين يسمى "ins-4"، وهو نشط في زوجين من الخلايا العصبية الحسية في رأس الدودة. ومن خلال مقارنة الديدم الطبيعية بتلك التي تعاني من طفرات جينية محددة، اكتشفوا أن تأثير الطفرة لم يكن نفسه في كل خلية. ففي نوع واحد من الطفرات، انخفضت كمية RNA الخاص بـ "ins-4" بشكل كبير في زوج واحد من الخلايا العصبية بينما ظلت كما هي في الزوج الآخر. وفي طفرة أخرى، ارتفتح مستويات RNA في زوج واحد من الخلايا العصبية بينما لم يتغير في الزوج الآخر. ويشير هذا الاكتشاف إلى أن هذين النوعين من الخلايا العصبية، اللذين هما جيران لبعضهما، يستجيبان للتغيرات الجينية بشكل مستقل عن بعضهما البعض.

كما قارنت الدراسة بين طريقتين لقياس نشاط الجينات: عد النقاط المتوهجة مقابل قياس إجمالي سطوع الضوء في الخلية. ووجد الباحثون أن مجرد عد النقاط الفردية يوفر صورة أوضح وأكثر موثوقية لما يحدث. فقياس السطوع الإجمالي كان يختلط بسهولة بضجيج الخلفية والاختلافات في كيفية إجراء التجربة في أيام مختلفة. ومن خلال عد النقاط مباشرة، استطاع الفريق رؤية الاختلافات بين الأنواع الجينية التي كانت مخفية عند استخدام طريقة السطوع. وقد سمحت هذه الدقة باكتشاف التغيرات الدقيقة في نشاط الجينات التي كان من الممكن أن تضيع لولا ذلك.

يوفر هذا العمل مجموعة أدوات عملية وبأسعار معقولة للعلماء الآخرين لاستخدامها. فقد أظهر الباحثون أنه يمكن استبدال المجموعات (kits) باهظة الثمن المطلوبة عادة لهذا النوع من العمل بمكونات مخصصة وأرخص ثمنًا، مما يجعل التقنية متاحة لمزيد من المختبرات. كما شاركوا كود الكمبيوتر الذي استخدموه لتحليل الصور، مما يسمح للآخرين بتبني الطريقة على الفور. ومن خلال جعل من السهل عد جزيئات RNA في الخلايا الفردية داخل حيوان كامل وحي، يفتح هذا المسار الباب أمام فهم أعمق لكيفية تحكم الجينات في تطور وسلوك الكائنات المعقدة، خلية تلو الأخرى.