An integrated pipeline to count individual transcripts with single-cell resolution

In elke levende cel vindt een complexe conversatie plaats. Genen, de instructiehandleidingen die in het DNA zijn opgeslagen, worden constant afgelezen om moleculen te produceren die RNA worden genoemd, die vervolgens de activiteiten van de cel sturen. Voor wetenschappers is het begrijpen van hoeveel van een specifiek RNA-molecuul er in een bepaalde cel aanwezig is, als het lezen van het volume van een gesprek; het onthult welke instructies worden opgevolgd en welke worden genegeerd. Hoewel onderzoekers al lang de gemiddelde hoeveelheid RNA in een grote groep cellen kunnen meten, bleef het een moeilijke uitdaging om precies te zien hoeveel kopieën er bestaan in een enkele, individuele cel binnen een levend organisme. Dit geldt met name voor minuscule organismen waar cellen dicht op elkaar gepakt zitten, en voor genen die zeer korte RNA-berichten produceren die moeilijk te vangen zijn. Zonder dit precieze beeld op celniveau missen wetenschappers vaak subtiele verschillen in hoe genen zich gedragen in verschillende delen van het lichaam, zelfs binnen hetzelfde dier.

Een team van onderzoekers heeft nu een nieuwe, gestroomlijnde methode ontwikkeld om dit probleem op te lossen met behulp van de microscopische rondworm Caenorhabditis elegans. Deze piepkleine worm is een favoriet van genetici omdat hij transparant is en een vast aantal cellen heeft, waarbij elk individu exact dezelfde anatomie bezit. De wetenschappers combineerden een krachtige chemische techniek genaamd Hybridization Chain Reaction met een gespecialiseerd computerprogramma om een pijplijn te creëren die individuele RNA-moleculen in specifieke cellen kan tellen. Door de wormen te bevriezen en te behandelen met fluorescerende kleurstoffen, lieten ze de RNA-moleculen oplichten als kleine sterren. Vervolgens gebruikten ze een microscoop om hoogwaardige 3D-beelden te maken en software om automatisch deze gloeiende stippen te vinden en te tellen. Deze aanpak werkt voor wormen in elke levensfase, van embryo's tot volwassen exemplaren, en kan meerdere verschillende genen tegelijkertijd volgen zonder dat de signalen door elkaar raken.

De onderzoekers testten hun nieuwe systeem door naar verschillende genen te kijken die bekend staan als actief in specifieke delen van de worm. In vroege embryo's identificeerden ze succesvol genen die alleen in bepaalde cellen worden ingeschakeld, wat overeenkwam met wat al bekend was over de ontwikkeling van de worm. Ze keken ook naar volwassen wormen en vonden genen die actief zijn in het voortplantingssysteem. Een belangrijke test betrof genen die zeer korte RNA-berichten produceren, die berucht moeilijk te bestuderen zijn met oudere methoden. De nieuwe pijplijn slaagde erin om deze korte berichten duidelijk te visualiseren, wat bewees dat de methode gevoelig genoeg is om zelfs de kleinste genetische signalen op te vangen. Het team demonstreerde ook dat ze drie verschillende genen in verschillende kleuren konden laten gloeien binnen dezelfde worm, wat aantoont dat de techniek complexe experimenten met meerdere genen aankan.

Om te zien of hun methode nieuwe biologische inzichten kon bieden, pasten de wetenschappers het toe om te bestuderen hoe mutaties de genexpressie in specifieke zenuwcellen beïnvloeden. Ze richtten zich op een gen genaamd ins-4, dat actief is in twee paren sensorische neuronen in de kop van de worm. Door normale wormen te vergelijken met wormen met specifieği genetische mutaties, ontdekten ze dat het effect van een mutatie niet in elke cel hetzelfde was. In één type mutant daalde de hoeveelheid ins-4 RNA aanzienlijk in één paar neuronen, terwijl het in het andere paar gelijk bleef. In een ander mutant ging het RNA-niveau omhoog in één paar neuronen, terwijl het in het andere paar niet veranderde. Deze bevinding suggereert dat deze twee typen zenuwcellen, die buren van elkaar zijn, onafhankelijk van elkaar reageren op genetische veranderingen.

De studie vergeleek ook twee manieren om genactiviteit te meten: het tellen van de gloeiende stippen versus het meten van de totale helderheid van het licht in een cel. De onderzoekers ontdekten dat het simpelweg tellen van de individuele stippen een veel duidelijker en betrouwbaarder beeld gaf van wat er gebeurde. Het meten van de totale helderheid werd gemakkelijker verward met achtergrondruis en variaties in hoe het experiment op verschillende dagen werd uitgevoerd. Door de stippen direct te tellen, kon het team verschillen tussen genetische types zien die verborgen bleven bij de helderheidsmethode. Deze precisie stelde hen in staat om subtiele veranderingen in genactiviteit te detecteren die anders gemist zouden zijn.

Het werk biedt een praktische en betaalbare toolkit voor andere wetenschappers. De onderzoekers lieten zien dat de dure kits die meestal vereist zijn voor dit soort werk, vervangen kunnen worden door goedkopere, op maat gemaakte componenten, waardoor de techniek toegankelijk wordt voor meer laboratoria. Ze deelden ook de computercode die ze gebruikten om de beelden te analyseren, zodat anderen de methode direct kunnen overnemen. Door het makkelijker te maken om RNA-moleculen in enkele cellen binnen een heel, levend dier te tellen, opent deze pijplijn de deur naar een dieper begrip van hoe genen de ontwikkeling en het gedrag van complexe organismen controleren, één cel tegelijk.