An integrated pipeline to count individual transcripts with single-cell resolution

Dentro de cada célula viva, se está llevando a cabo una conversación compleja. Los genes, los manuales de instrucciones almacenados en el ADN, están siendo leídos constantemente para producir moléculas llamadas ARN, que luego guían las actividades de la célula. Para los científicos, comprender cuánto de una molécula de ARN específica existe en una célula particular es como leer el volumen de una conversación; revela qué instrucciones se están siguiendo y cuáles se están ignorando. Si bien los investigadores han sido capaces durante mucho tiempo de medir la cantidad promedio de ARN en un grupo grande de células, ver exactamente cuántas copias existen en una sola célula individual dentro de un organismo vivo ha seguido siendo un desafío difícil. Esto es especialmente cierto para organismos diminutos donde las células están agrupadas estrechamente, y para genes que producen mensajes de ARN muy cortos que son difíciles de capturar. Sin esta visión precisa de célula única, los científicos a menudo pierden diferencias sutiles en cómo se comportan los genes en diferentes partes del cuerpo, incluso dentro del mismo animal.

Un equipo de investigadores ha construido ahora un nuevo método simplificado para resolver este problema utilizando el nematodo microscópico Caenorhabditis elegans. Este diminuto gusano es un favorito de los genetistas porque es transparente y tiene un número fijo de células, con cada individuo poseyendo exactamente la misma anatomía. Los científicos combinaron una poderosa técnica química llamada Reacción de Cadena de Hibridación con un programa informático especializado para crear un flujo de trabajo que puede contar moléculas de ARN individuales dentro de células específicas. Al congelar y tratar a los gusanos con tintes fluorescentes, hicieron que las moléculas de ARN brillaran como pequeñas estrellas. Luego, utilizaron un microscopio para tomar imágenes 3D de alta resolución y un software para encontrar y contar automáticamente estos puntos brillantes. Este enfoque funciona para gusanos en cualquier etapa de la vida, desde embriones hasta adultos, y puede rastrear múltiples genes diferentes al mismo tiempo sin que las señales se mezclen.

Los investigadores probaron su nuevo sistema observando varios genes conocidos por estar activos en partes específicas del gusano. En embriones tempranos, identificaron con éxito genes que se activan solo en ciertas células, coincidiendo con lo que ya se sabía sobre cómo se desarrolla el gusano. También observaron gusanos adultos y encontraron genes activos en el sistema reproductivo. Una prueba clave involucró genes que producen mensajes de ARN muy cortos, que son notoriamente difíciles de estudiar con métodos más antiguos. El nuevo flujo de trabajo logró visualizar estos mensajes cortos claramente, demostrando que el método es lo suficientemente sensible como para captar incluso las señales genéticas más pequeñas. El equipo también demostró que podía observar tres genes diferentes brillando en diferentes colores dentro del mismo gusano, mostrando que la técnica puede manejar experimentos complejos de múltiples genes.

Para ver si su método podía revelar nuevos conocimientos biológicos, los científicos lo aplicaron para estudiar cómo las mutaciones afectan la expresión génica en células nerviosas específicas. Se centraron en un gen llamado ins-4, que está activo en dos pares de neuronas sensoriales en la cabeza del gusano. Al comparar gusanos normales con aquellos que tienen mutaciones genéticas específicas, descubrieron que el efecto de una mutación no era el mismo en cada célula. En un tipo de mutante, la cantidad de ARN de ins-4 cayó significamente en un par de neuronas pero se mantuvo igual en el otro par. En otro mutante, los niveles de ARN aumentaron en un par de neuronas pero no cambiaron en el otro par. Este hallazgo sugiere que estos dos tipos de células nerviosas, que son vecinas, responden a los cambios genéticos de forma independiente entre sí.

El estudio también comparó dos formas de medir la actividad génica: contar los puntos brillantes frente a medir el brillo total de la luz en una célula. Los investigadores encontraron que el simple hecho de contar los puntos individuales proporcionaba una imagen mucho más clara y confiable de lo que estaba sucediendo. Medir el brillo total era más fácilmente confundido por el ruido de fondo y las variaciones en cómo se realizó el experimento en diferentes días. Al contar los puntos directamente, el equipo pudo ver diferencias entre tipos genéticos que estaban ocultas cuando se utilizaba el método de brillo. Esta precisión permitió detectar cambios sutiles en la actividad génica que habrían pasado desapercibidos con el método de brillo.

El trabajo proporciona un conjunto de herramientas práctico y asequible para otros científicos. Los investigadores demostraron que los costosos kits que usualmente se requieren para este tipo de trabajo podrían ser reemplazados por componentes personalizados más económicos, haciendo la técnica accesible para más laboratorios. También compartieron el código informático que usaron para analizar las imágenes, permitiendo que otros adopten el método de inmediato. Al hacer más fácil contar las moléculas de ARN en células individuales dentro de un animal completo y vivo, este flujo de trabajo abre la puerta a una comprensión más profunda de cómo los genes controlan el desarrollo y el comportamiento de organismos complejos, una célula a la vez.