An integrated pipeline to count individual transcripts with single-cell resolution

在每一个活细胞内部，都进行着一场复杂的对话。基因——存储在DNA中的指令手册——正在不断地被读取以产生被称为RNA的分子，随后这些分子引导着细胞的活动。对于科学家而言，了解特定RNA分子在特定细胞中存在多少，就像是在阅读一场对话的音量；它揭示了哪些指令正在被执行，而哪些指令被忽略了。虽然研究人员长期以来一直能够测量大量细胞中RNA的平均含量，但在活体生物内，观察单个独立细胞中究竟存在多少拷贝仍然是一个巨大的挑战。对于那些细胞排列紧密的小型生物，以及那些产生极短且难以捕捉的RNA信息的基因来说，情况尤其如此。由于缺乏这种精确的单细胞视角，科学家经常会错过基因在身体不同部位表现出的细微差异，甚至是在同一只动物体内。

现在，一个研究小组开发出了一种新的、精简的方法来解决这一问题，并使用了微小的圆线虫（Caenorhabditis elegans）作为研究对象。这种微小的蠕虫是遗传学家的宠儿，因为它具有透明性且拥有固定的细胞数量，每一只个体的解剖结构都完全相同。科学家们将一种名为杂交链式反应（Hybridization Chain Reaction）的强大化学技术与专门的计算机程序相结合，创建了一个能够计数特定细胞内单个RNA分子的流程。通过冷冻并用荧光染料处理这些蠕虫，他们使RNA分子像微小的星星一样闪闪发光。随后，他们利用显微镜拍摄高分辨率的3D图像，并使用软件自动寻找并计数这些发光的点。这种方法适用于任何生命阶段的蠕虫，从胚胎到成年期，并且可以在不混淆信号的情况下同时追踪多种不同的基因。

研究人员通过观察已知在蠕虫特定部分活跃的几种基因，测试了他们的新系统。在早期胚胎中，他们成功识别了仅在某些细胞中开启的基因，这与已知的蠕虫发育过程相吻合。他们还观察了成年蠕虫，并发现了活跃于生殖系统的基因。一项关键测试涉及产生极短RNA信息的基因，这类基因在旧方法中是出了名的难以研究。新的流程成功地清晰可视化了这些短消息，证明了该方法足够灵敏，甚至能捕捉到最微小的遗传信号。团队还展示了他们可以在同一只蠕虫内观察三种以不同颜色闪烁的不同基因，表明该技术可以处理复杂的、多基因的实验。

为了观察该方法是否能揭示新的生物学见解，科学家们应用它来研究突变如何影响特定神经细胞中的基因表达。他们聚焦于一个名为 ins-4 的基因，该基因在蠕虫头部的两对感觉神经元中活跃。通过对比正常蠕虫与带有特定基因突变的蠕虫，他们发现突变的影响在每个细胞中并不相同。在一种类型的突变体中，ins-4 RNA 的含量在一对神经元中显著下降，但在另一对中保持不变。在另一种突变体中，RNA 水平在其中一对神经元中上升，而在另一对中则没有变化。这一发现表明，这两类相邻的神经细胞对遗传变化的反应是相互独立的。

研究还比较了两种测量基因活动的方法：计数发光的点与测量细胞内的总亮度。研究人员发现，直接计数单个点所提供的图像更加清晰且可靠。测量总亮度更容易受到背景噪音以及实验在不同日期进行时产生的差异的影响。通过直接计数这些点，团队能够看到在使用亮度法时被掩盖的遗传类型之间的差异。这种精确度使得他们能够检测到那些原本会被忽略的基因活动中的细微变化。

这项工作提供了一个实用且负担得起的工具包供其他科学家使用。研究人员展示了通常用于此类工作的昂贵试剂盒可以被更便宜的定制组件所取代，从而使该技术能被更多实验室采用。他们还分享了用于分析图像的计算机代码，允许他人立即采用该方法。通过使在整个活体动物内计数单细胞内RNA分子变得更加容易，这一流程为深入理解基因如何控制复杂生物的发育和行为打开了大门——一次专注于一个细胞。