An integrated pipeline to count individual transcripts with single-cell resolution

あらゆる生細胞の中で、複雑な対話が行われています。DNAに格納された説明書である遺伝子は、RNAと呼ばれる分子を生成するために絶えず読み取られており、そのRNAが細胞の活動を導いています。科学者にとって、特定のRNA分子がどれだけ存在するかを理解することは、会話の音量を読み取るようなものです。それによって、どの指示が実行され、どの指示が無視されているのかが明らかになります。研究者は長い間、細胞の大きな集団におけるRNAの平均量を測定することはできましたが、生きている生物の中の特定の、個々の細胞内に正確に何個のコピーが存在するかを見ることは、困難な課題であり続けてきました。これは、細胞が密集している小さな生物や、捕らえるのが難しい非常に短いRNAメッセージを生成する遺伝子において、特に顕著です。この精密なシングルセル（単一細胞）の視点がなければ、科学者は、同じ動物の中でさえ、体の異なる部位で遺伝子がどのように振る舞うかという微妙な違いを見逃してしまうことがよくあります。

研究チームは、微小な線虫であるCaenorhabditis elegansを用いて、この問題を解決するための新しい合理化された手法を構築しました。この小さな虫は、透明であり、固定された細胞数を持ち、個体ごとに全く同じ解剖学的構造を持っているため、遺伝学者の間で好まれています。科学者たちは、ハイブリダイゼーション連鎖反応（Hybridization Chain Reaction）と呼ばれる強力な化学的手法と、特化したコンピュータプログラムを組み合わせ、特定の細胞内の個々のRNA分子をカウントできるパイプラインを作り上げました。彼らは、虫を凍結させ、蛍光染料で処理することで、RNA分子を小さな星のように光らせました。そして、高解像度の3D画像を取得するために顕微鏡を使用し、ソフトウェアを用いて、これらの光る点を自動的に探し出し、カウントしました。このアプローチは、胚から成体まで、あらゆる成長段階の線虫に対して機能し、信号が混ざり合うことなく、複数の異なる遺伝子を同時に追跡することができます。

研究者たちは、既知の特定の部位で活性化しているいくつかの遺伝子を見て、新しいシステムをテストしました。初期胚において、彼らは特定の細胞でのみオンになる遺伝子を特定することに成功し、それは線虫がどのように発達するかについて既に知られている事実と一致していました。また、成体の線虫についても調査し、生殖系で活性化している遺伝子を見つけました。重要なテストとして、古い手法では研究が極めて困難とされる、非常に短いRNAメッセージを生成する遺伝子を取り上げました。新しいパイプラインは、これらの短いメッセージを明確に可視化することに成功し、この手法が極めて小さな遺伝的信号さえも捉えるのに十分な感度を備えていることを証明しました。チームはまた、同じ線虫の中で3つの異なる遺伝子が異なる色で光っている様子を見せることで、この技術が複雑なマルチジーン（多遺伝子）実験にも対応できることを示しました。

彼らの手法が新たな生物学的洞察を明らかにできるかどうかを確認するため、科学者たちは、変異が特定の神経細胞における遺伝子発現にどのように影響するかを研究するためにこの手法を適用しました。彼らは、線虫の頭部の2対の感覚ニューロンで活性化しているins-4と呼ばれる遺伝子に焦点を当てました。正常な線虫と特定の遺伝子変異を持つ線虫を比較することで、変異の影響がすべての細胞で同一ではないことを発見しました。あるタイプの変異体では、ins-4のRNA量は一方のニューロンのペアで大幅に減少しましたが、もう一方のペアでは変化しませんでした。別の変異体では、一方のニューロンのペアではRNAレベルが上昇しましたが、もう一方のペアでは変化しませんでした。この発見は、隣接するこれら2種類の神経細胞が、遺伝的な変化に対してそれぞれ独立して反応していることを示唆しています。

この研究ではまた、遺伝子の活性を測定する2つの方法、すなわち、光る点のカウントと、細胞内の全光量の測定を比較しました。研究者たちは、単に個々の点をカウントする方が、はるかに明確で信頼性の高い全体像を提供することを発見しました。全光量を測定する方法は、背景ノイズや、実験を行う日による変動の影響を受けやすいことが分かりました。直接ドットをカウントすることで、チームは、明るさによる測定法では隠されてしまう遺伝的タイプ間の違いを見出すことができました。この精密さにより、従来の明るさによる方法では見逃されていたであろう、遺伝子活動の微妙な変化を検出することが可能になりました。

この研究は、他の科学者が使用できる実用的で手頃な価格のツールキットを提供しています。研究者たちは、通常この種の作業に必要とされる高価なキットを、より安価なカスタムメイドのコンポーネントで代替できることを示し、この技術をより多くの研究所が利用できるようにしました。彼らはまた、画像の解析に使用したコンピュータコードも共有しており、他の人々がすぐにこの手法を採用できるようにしています。生きた動物全体における単一細胞内のRNA分子をカウントすることを容易にすることで、このパイプラインは、一つ一つの細胞を通じて、複雑な生物の発達と行動を遺伝子がどのように制御しているかという、より深い理解への扉を開いています。