An integrated pipeline to count individual transcripts with single-cell resolution

Dentro ogni cellula vivente, sta avvenendo una conversazione complessa. I geni, i manuali di istruzioni conservati nel DNA, vengono costantemente letti per produrre molecole chiamate RNA, che poi guidano le attività della cellula. Per gli scienziati, capire quanto di una specifica molecola di RNA esista in una particolare cellula è come leggere il volume di una conversazione; rivela quali istruzioni vengono seguite e quali vengono ignorate. Sebbene i ricercatori siano stati a lungo in grado di misurare la quantità media di RNA in un grande gruppo di cellule, vedere esattamente quante copie esistano in una singola cellula individuale all'interno di un organismo vivente è rimasto una sfida difficile. Ciò è particolarmente vero per gli organismi minuscoli dove le cellule sono ammassate strettamente tra loro, e per i geni che producono messaggi di RNA molto brevi che sono difficili da catturare. Senza questa visione precisa a singola cellula, gli scienziati spesso perdono sottili differenze nel modo in cui i geni si comportano in diverse parti del corpo, anche all'interno dello stesso animale.

Un team di ricercatori ha costruito un nuovo metodo snello per risolvere questo problema utilizzando il verme microscopico Caenorhabditis elegans. Questo piccolo verme è un preferito dei genetisti perché è trasparente e ha un numero fisso di cellule, con ogni individuo che possiede esattamente la stessa anatomia. Gli scienziati hanno combinato una potente tecnica chimica chiamata Reazione a Catena di Ibridazione con un programma informatico specializzato per creare una pipeline che possa contare le singole molecole di RNA all'interno di cellule specifiche. Congelando e trattando i vermi con coloranti fluorescenti, hanno fatto sì che le molecole di RNA brillassero come piccole stelle. Hanno poi usato un microscopio per scattare immagini 3D ad alta risoluzione e un software per trovare e contare automaticamente questi punti luminosi. Questo approccio funziona per i vermi in qualsiasi fase della vita, dagli embrioni agli adulti, e può tracciare molteplici geni diversi contemporaneamente senza che i segnali si mescolino.

I ricercatori hanno testato il loro nuovo sistema osservando diversi geni noti per essere attivi in parti specifiche del verme. Negli embrioni precoci, hanno identificato con successo geni che si attivano solo in certe cellule, corrispondendo a quanto già noto su come si sviluppa il verme. Hanno anche osservato vermi adulti e hanno trovato geni attivi nel sistema riproduttivo. Un test chiave ha riguardato geni che producono messaggi di RNA molto brevi, che sono notoriamente difficili da studiare con i metodi più vecchi. La nuova pipeline è riuscita a visualizzare chiaramente questi messaggi brevi, dimostrando che il metodo è abbastanza sensibile da catturare anche i segnali genetici più piccoli. Il team ha anche dimostrato di poter osservare tre diversi geni brillare in colori differenti all'interno dello stesso verme, mostrando che la tecnica può gestire esperimenti complessi a più geni.

Per vedere se il loro metodo potesse rivelare nuove intuizioni biologiche, gli scienziati lo hanno applicato per studiare come le mutazioni influenzano l'espressione genica in specifiche cellule nervose. Si sono concentrati su un gene chiamato ins-4, che è attivo in due coppie di neuroni sensoriali nella testa del verme. Confrontando i vermi normali con quelli che presentano specifiche mutazioni genetiche, hanno scoperto che l'effetto di una mutazione non era lo stesso in ogni cellula. In un tipo di mutante, la quantità di RNA di ins-4 è diminuita significamente in una coppia di neuroni ma è rimasta invariata nell'altra coppia. In un altro mutante, i livelli di RNA sono aumentati in una coppia di neuroni ma non sono cambiati nell'altra. Questa scoperta suggerisce che questi due tipi di cellule nervose, che sono vicine, rispondono ai cambiamenti genetici in modo indipendente l'una dall'altra.

Lo studio ha anche confrontato due modi per misurare l'attività genica: contare i punti luminosi rispetto al misurare la brillantezza totale della luce in una cellula. I ricercatori hanno scoperto che il semplice conteggio dei singoli punti forniva un quadro molto più chiaro e affidabile di ciò che stava accadendo. Misurare la brillantezza totale era più facilmente confuso dal rumore di fondo e dalle variazioni nel modo in cui l'esperimento veniva eseguito in giorni diversi. Contando direttamente i punti, il team poteva vedere differenze tra i tipi genetici che rimanevano nascoste quando si utilizzava il metodo della brillantezza. Questa precisione ha permesso loro di rilevare cambiamenti sottili nell'attività genica che sarebbero stati persi con il metodo della brillantezza.

Il lavoro fornisce un kit pratico ed economico per altri scienziati. I ricercatori hanno dimostrato che i kit costosi solitamente richiesti per questo tipo di lavoro possono essere sostituiti con componenti personalizzati ed economici, rendendo la tecnica accessibile a più laboratori. Hanno anche condiviso il codice informatico utilizzato per analizzare le immagini, permettendo ad altri di adottare immediatamente il metodo. Rendendo più facile contare le molecole di RNA in singole cellule all'interno di un intero animale vivente, questa pipeline apre la porta a una comprensione più profonda di come i geni controllano lo sviluppo e il comportamento di organismi complessi, una cellula alla volta.