An integrated pipeline to count individual transcripts with single-cell resolution

In jeder lebenden Zelle findet ein komplexes Gespräch statt. Gene, die in der DNA gespeicherten Bedienungsanleitungen, werden ständig gelesen, um Moleküle namens RNA zu produzieren, die dann die Aktivitäten der Zelle leiten. Für Wissenschaftler ist das Verständnis darüber, wie viel eines bestimmten RNA-Moleküls in einer bestimmten Zelle existiert, vergleichbar mit dem Lesen des Volumens eines Gesprächs; es offenbart, welche Anweisungen befolgt und welche ignoriert werden. Während Forscher schon lange in der Lage waren, die durchschnittliche Menge an RNA in einer großen Gruppe von Zellen zu messen, blieb es eine schwierige Herausforderung, genau zu sehen, wie viele Kopien in einer einzelnen, individuellen Zelle innerhalb eines lebenden Organismus existieren. Dies gilt insbesondere für winzige Organismen, bei denen die Zellen dicht beieinander liegen, und für Gene, die sehr kurze RNA-Botschaften produzieren, die schwer einzufangen sind. Ohne diese präzise Ansicht auf Einzelzell-Ebene übersehen Wissenschaftler oft subtile Unterschiede im Verhalten von Genen in verschiedenen Teilen des Körpers, selbst innerhalb desselben Tieres.

Ein Forschungsteam hat nun eine neue, optimierte Methode entwickelt, um dieses Problem unter Verwendung des mikroskopisch kleinen Fadenwurms Caenorhabditis elegans zu lösen. Dieser winzige Wurm ist ein Liebling der Genetiker, da er transparent ist und eine feste Anzahl von Zellen besitzt, wobei jedes Individuum exakt dieselbe Anatomie aufweist. Die Wissenschaftler kombinierten eine leistungsstarke chemische Technik namens Hybridisierungs-Kettenreaktion (Hybridization Chain Reaction) mit einem spezialisierten Computerprogramm zu einer Pipeline, die einzelne RNA-Moleküle in spezifischen Zellen zählen kann. Indem sie die Würmer einfroren und mit fluoreszierenden Farbstoffen behandelten, ließen sie die RNA-Moleküle wie kleine Sterne leuchten. Anschließend nutzten sie ein Mikroskop, um hochauflösende 3D-Bilder aufzunehmen, sowie eine Software, um die leuchtenden Punkte automatisch zu finden und zu zählen. Dieser Ansatz funktioniert für Würmer in jedem Lebensstadium, vom Embryo bis zum adulten Tier, und kann mehrere verschiedene Gene gleichzeitig verfolgen, ohne dass sich die Signale vermischen.

Die Forscher testeten ihr neues System, indem sie mehrere Gene untersuchten, die in spezifischen Teilen des Wurms aktiv sind. In frühen Embryonen identifizierten sie erfolgreich Gene, die nur in bestimmten Zellen aktiviert werden, was mit dem bereits bekannten Wissen über die Entwicklung des Wurms übereinstimmte. Sie untersuchten auch adulte Würmer und fanden Gene, die im Fortpflanzungssystem aktiv sind. Ein entscheidender Test betraf Gene, die sehr kurze RNA-Botschaften produzieren, welche mit älteren Methoden notorisch schwer zu untersuchen sind. Die neue Pipeline war in der Lage, diese kurzen Botschaften klar zu visualisieren, was bewies, dass die Methode empfindlich genug ist, um selbst die kleinsten genetischen Signale einzufangen. Das Team demonstrierte zudem, dass sie drei verschiedene Gene in unterschiedlichen Farben innerhalb desselben Wurms zum Leuchten bringen konnte, was zeigte, dass die Technik komplexe Multi-Gen-Experimente bewältigen kann.

Um zu sehen, ob ihre Methode neue biologische Erkenntnisse liefern könnte, wandten die Wissenschaftler sie an, um zu untersuchen, wie Mutationen die Genexpression in spezifischen Nervenzellen beeinflussen. Sie konzentrierten sich auf ein Gen namens ins-4, das in zwei Paaren von Sinnesneuronen im Kopf des Wurms aktiv ist. Durch den Vergleich normaler Würmer mit solchen, die spezifische genetische Mutationen aufweisen, entdeckten sie, dass die Auswirkung einer Mutation nicht in jeder Zelle gleich ist. In einem Typ von Mutanten sank die Menge der ins-4-RNA in einem Paar von Neuronen signifikant, während sie im anderen Paar gleich blieb. In einem anderen Mutanten stiegen die RNA-Level in einem Paar von Neuronen an, während sie im anderen Paar unverändert blieben. Dieser Befund deutet darauf an, dass diese zwei Arten von Nervenzellen, die Nachbarn sind, auf genetische Veränderungen unabhängig voneinander reagieren.

Die Studie verglich auch zwei Arten, die Genaktivität zu messen: das Zählen der leuchtenden Punkte gegenüber der Messung der gesamten Helligkeit des Lichts in einer Zelle. Die Forscher fanden heraus, dass das direkte Zählen der einzelnen Punkte ein viel klareres und zuverlässigeres Bild dessen lieferte, was geschah. Die Messung der gesamten Helligkeit wurde leichter durch Hintergrundrauschen und Variationen in der Durchführung des Experiments an verschiedenen Tagen gestört. Durch das direkte Zählen der Punkte konnte das Team Unterschiede zwischen den genetischen Typen erkennen, die bei der Helligkeitsmethode verborgen geblieben wären. Diese Präzision ermöglichte es, subtile Änderungen in der Genaktivität zu detektieren, die mit der Helligkeitsmethode unentdeckt geblieben wären.

Die Arbeit stellt ein praktisches und erschwingliches Toolkit für andere Wissenschaftler bereit. Die Forscher zeigten, dass die teuren Kits, die normalerweise für diese Art von Arbeit erforderlich sind, durch günstigere, maßgeschneiderte Komponenten ersetzt werden können, was die Technik für mehr Laboratorien zugänglich macht. Sie stellten auch den von ihnen verwendeten Computercode zur Bildanalyse zur Verfügung, damit andere die Methode sofort übernehmen können. Indem sie es einfacher machen, RNA-Moleküle in Einzelzellen innerhalb eines ganzen, lebenden Tieres zu zählen, öffnet diese Pipeline die Tür zu einem tieferen Verständnis darüber, wie Gene die Entwicklung und das Verhalten komplexer Organismen steuern – eine Zelle nach der anderen.