An integrated pipeline to count individual transcripts with single-cell resolution

모든 살아있는 세포 내부에서는 복잡한 대화가 일어나고 있습니다. DNA에 저장된 설명서인 유전자는 RNA라고 불리는 분자를 생성하기 위해 끊임없이 읽히며, 이 RNA는 세포의 활동을 안내합니다. 과학자들에게 특정 RNA 분자가 얼마나 존재하는지 이해하는 것은 대화의 양을 읽는 것과 같습니다. 이는 어떤 지침이 따르고 있고 어떤 지침이 무시되고 있는지를 밝혀줍니다. 연구자들은 오랫동안 대규모 세포 집단 내의 평균적인 RNA 양을 측정할 수 있었지만, 살아있는 유기체 내의 개별적인 단일 세포 안에 정확히 몇 개의 복사본이 존재하는지 보는 것은 어려운 과제로 남아 있었습니다. 이는 특히 세포들이 빽빽하게 모여 있는 아주 작은 생물체나, 포착하기 어려운 매우 짧은 RNA 메시지를 생성하는 유전자의 경우 더욱 그러했습니다. 이러한 정밀한 단일 세포 관점이 없다면, 과학자들은 동일한 동물 내에서도 신체의 서로 다른 부위에서 유전자가 어떻게 다르게 행동하는지에 대한 미묘한 차이를 놓치기 쉽습니다.

연구팀은 이제 미세한 둥근 벌레인 Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충)를 사용하여 이 문제를 해결할 수 있는 새롭고 간소화된 방법을 개발했습니다. 이 작은 벌레는 투명하고 모든 개체가 정확히 동일한 해부학적 구조를 가지며 세포 수가 고정되어 있어 유전학자들이 즐겨 찾는 모델입니다. 과학자들은 하이브리드 체인 반응(Hybridization Chain Reaction)이라는 강력한 화학 기술과 특화된 컴퓨터 프로그램을 결os하여, 특정 세포 내의 개별 RNA 분자를 셀 수 있는 파이프라인을 만들었습니다. 그들은 벌레를 얼리고 형광 염료로 처리함으로써 RNA 분자가 마치 작은 별처럼 빛나게 만들었습니다. 그런 다음 현미경을 사용하여 고해상도 3D 이미지를 촬영하고 소프트웨어를 통해 빛나는 점들을 자동으로 찾아내어 숫자를 셌습니다. 이 방식은 배아부터 성체에 이르기까지 벌레의 모든 생애 단계에서 작동하며, 신호가 서로 섞이지 않도록 하면서 여러 가지 서로 다른 유전자를 동시에 추적할 수 있습니다.

연구진은 이 새로운 시스템을 테스트하기 위해 특정 부위에서 활성화되는 것으로 알려진 몇몇 유전자들을 관찰했습니다. 초기 배아 단계에서, 그들은 벌레의 발달 과정에 대해 이미 알려진 바와 일치하게 특정 세포에서만 켜지는 유전자들을 성공적으로 식별했습니다. 또한 성체 벌레를 관찰하여 생식계에서 활성화되는 유전자들을 찾아냈습니다. 핵심적인 테스트는 기존 방식으로는 연구하기 까다롭기로 유명한 매우 짧은 RNA 메시지를 생성하는 유전자들을 대상으로 진행되었습니다. 새로운 파이프라인은 이 짧은 메시지들을 명확하게 시각화하는 데 성공했으며, 이는 이 방법이 아주 작은 유전적 신호까지도 잡아낼 수 있을 만큼 민감하다는 것을 증명했습니다. 연구팀은 또한 한 마리의 벌레 안에서 세 가지 서로 다른 유전자가 각기 다른 색으로 빛나는 것을 보여줌으로써, 이 기술이 복잡한 다중 유전자 실험을 처리할 수 있음을 입증했습니다.

이들의 방법이 새로운 생물학적 통찰력을 드러낼 수 있는지 확인하기 위해, 과학자들은 돌연변이가 특정 신경 세포의 유전자 발현에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 데 이 기술을 적용했습니다. 그들은 벌레의 머리에 있는 두 쌍의 감각 뉴런에서 활성화되는 ins-4라는 유전자에 집중했습니다. 정상적인 벌레와 특정 유전적 돌연변이가 있는 벌레를 비교함으로써, 그들은 돌연변이의 영향이 모든 세포에서 동일하지 않다는 것을 발견했습니다. 한 종류의 돌연변이에서는 ins-4 RNA의 양이 한 쌍의 뉴런에서는 크게 감소했지만 다른 한 쌍에서는 그대로 유지되었습니다. 또 다른 돌연변이에서는 한 쌍의 뉴런에서 RNA 수준이 올라갔지만 다른 한 쌍에서는 변하지 않았습니다. 이러한 발견은 이 두 종류의 신경 세포가 서로 이웃하고 있음에도 불구하고 유전적 변화에 독립적으로 반응한다는 것을 시사합니다.

연구는 또한 유전자 활성을 측정하는 두 가지 방법, 즉 빛나는 점의 개수를 세는 것과 세포 내 전체 빛의 밝기를 측정하는 것을 비교했습니다. 연구진은 개별 점을 직접 세는 것이 세포 내에서 일어나는 일을 훨씬 더 명확하고 신뢰할 수 있는 그림으로 제공한다는 것을 발견했습니다. 전체 밝기를 측정하는 방식은 배경 노이즈와 실험을 수행하는 날마다 발생하는 변동에 의해 쉽게 혼동될 수 있었습니다. 점을 직접 세는 방식을 통해 연구팀은 밝기 측정법을 사용했을 때는 가려져 있던 유전적 유형 간의 차이를 포착할 수 있었습니다. 이러한 정밀함 덕분에 그들은 그렇지 않았다면 놓쳤을 유전자 활동의 미묘한 변화를 감지할 수 있었습니다.

이 연구는 다른 과학자들이 사용할 수 있는 실용적이고 저렴한 도구 세트를 제공합니다. 연구진은 이와 같은 작업에 통상적으로 요구되는 값비싼 키트들을 맞춤 제작된 저렴한 구성 요소들로 대체할 수 있음을 보여주었으며, 이를 통해 기술을 더 많은 실험실에서 접근 가능하게 만들었습니다. 또한 그들은 이미지 분석에 사용한 컴퓨터 코드도 공유하여 다른 이들이 즉시 이 방법을 채택할 수 있도록 했습니다. 살아있는 전체 동물 내의 단일 세포에서 RNA 분자를 세는 것을 더 용이하게 만듦으로써, 이 파이프라인은 한 번에 한 세포씩, 복잡한 유기체의 발달과 행동을 조절하는 유전자에 대한 더 깊은 이해로 가는 문을 열어줍니다.