An integrated pipeline to count individual transcripts with single-cell resolution

Dentro de cada célula viva, uma conversa complexa está ocorrendo. Os genes, os manuais de instrução armazenados no DNA, estão sendo constantemente lidos para produzir moléculas chamadas RNA, que então guiam as atividades da célula. Para os cientistas, entender quanto de uma molécula de RNA específica existe em uma determinada célula é como ler o volume de uma conversa; isso revela quais instruções estão sendo seguidas e quais estão sendo ignoradas. Embora os pesquisadores há muito tempo consigam medir a quantidade média de RNA em um grande grupo de células, ver exatamente quantas cópias existem em uma única célula individual dentro de um organismo vivo tem sido um desafio difícil. Isso é especialmente verdadeiro para organismos minúsculos onde as células estão compactadas de forma apertada, e para genes que produzem mensagens de RNA muito curtas que são difíceis de capturar. Sem essa visão precisa de célula única, os cientistas frequentemente perdem diferenças sutis em como os genes se comportam em diferentes partes do corpo, mesmo dentro do mesmo animal.

Uma equipe de pesquisadores construiu agora um novo método simplificado para resolver este problema usando o verme microscópico Caenorhabditis elegans. Este verme minúsculo é um favorito dos geneticistas porque é transparente e possui um número fixo de células, com cada indivíduo tendo exatamente a mesma anatomia. Os cientistas combinaram uma poderosa técnica química chamada Reação de Cadeia de Hibridização com um programa de computador especializado para criar um fluxo de trabalho que pode contar moléculas de RNA individuais dentro de células específicas. Ao congelar e tratar os vermes com corantes fluorescentes, eles fizeram as moléculas de RNA brilharem como pequenas estrelas. Eles então usaram um microscópio para tirar imagens 3D de alta resolução e um software para encontrar e contar automaticamente esses pontos brilhantes. Esta abordagem funciona para vermes em qualquer estágio de vida, de embriões a adultos, e pode rastrear múltiplos genes diferentes ao mesmo tempo sem que os sinais se misturem.

Os pesquisadores testaram seu novo sistema observando vários genes conhecidos por serem ativos em partes específicas do verme. Em embriões precoces, eles identificaram com sucesso genes que se ligam apenas em certas células, correspondendo ao que já era conhecido sobre como o verme se desenvolve. Eles também observaram vermes adultos e encontraram genes ativos no sistema reprodutor. Um teste fundamental envolveu genes que produzem mensagens de RNA muito curtas, que são notoriamente difíceis de estudar com métodos mais antigos. O novo fluxo de trabalho conseguiu visualizar essas mensagens curtas claramente, provando que o método é sensível o suficiente para capturar até mesmo os menores sinais genéticos. A equipe também demonstrou que poderia observar três genes diferentes brilhando em cores diferentes dentro do mesmo verme, mostrando que a técnica pode lidar com experimentos complexos de múltiplos genes.

Para ver se seu método poderia revelar novos insights biológicos, os cientistas o aplicaram para estudar como mutações afetam a expressão gênica em células nervosas específicas. Eles focaram em um gene chamado ins-4, que é ativo em dois pares de neurônios sensoriais na cabeça do verme. Ao comparar vermes normais com aqueles que possuem mutações genéticas específicas, eles descobriram que o efeito de uma mutação não era o mesmo em todas as células. Em um tipo de mutante, a quantidade de RNA de ins-4 caiu significamente em um par de neurônios, mas permaneceu a mesma no outro par. Em outro mutante, os níveis de RNA subiram em um par de neurônios, mas não mudaram no outro. Essa descoberta sugere que esses dois tipos de células nervosas, que são vizinhas, respondem a mudanças genéticas de forma independente uma da outra.

O estudo também comparou duas maneiras de medir a atividade gênica: contar os pontos brilhantes versus medir o brilho total da luz em uma célula. Os pesquisadores descobriram que simplesmente contar os pontos individuais fornecia uma imagem muito mais clara e confiável do que estava acontecendo. Medir o brilho total era mais facilmente confundido pelo ruído de fundo e pelas variações na forma como o experimento era realizado em diferentes dias. Ao contar os pontos diretamente, a equipe pôde ver diferenças entre tipos genéticos que ficavam ocultas quando se usava o método de brilho. Essa precisão permitiu que detectassem mudanças sutis na atividade gênica que teriam sido perdidas com o método de brilho.

O trabalho fornece um conjunto de ferramentas prático e acessível para outros cientistas usarem. Os pesquisadores mostraram que os kits caros normalmente exigidos para este tipo de trabalho poderiam ser substituídos por componentes customizados mais baratos, tornando a técnica acessível a mais laboratórios. Eles também compartilharam o código de computador que usaram para analisar as imagens, permitindo que outros adotem o método imediatamente. Ao tornar mais fácil contar moléculas de RNA em células únicas dentro de um animal inteiro e vivo, este fluxo de trabalho abre as portas para uma compreensão mais profunda de como os genes controlam o desenvolvimento e o comportamento de organismos complexos, uma célula de cada vez.