De novo design of flexible protein interactions with GuideFlip

في العالم المجهري لعلم الأحياء، تعتمد الحياة غالباً على لعبة دقيقة من التعرف الجزيئي. فالبروتينات، وهي محركات الخلية، يجب أن تجد وتتمسك بشركاء محددين لإرسال الإشارات، أو بناء الهياكل، أو محاربة العدوى. لعقود من الزمن، فهم العلماء أن العديد من هذه التفاعلات تعتمد على مبدأ "القفل والمفتاح"، حيث يتناسب بروتين صلب تماماً داخل هدف صلب. ومع ذلك، فإن الطبيعة أكثر سيولة مما يوحي به هذه الصورة البسيطة. فالعديد من البروتينات الحيوية هي بروتينات "غير منظمة جوهرياً"، مما يعني أنها لا تملك شكلاً ثابتاً حتى تلتقي بشريكها. إنها تشبه الخيوط المتشابكة التي لا تتخذ شكلاً محدداً إلا بمجرد ارتباطها بشيء آخر. تسمح هذه المرونة لهذه البروتينات بأداء مهام معقدة، مثل تنظيم نمو الخلايا أو الاستجابة للإجهاد، لكنها تجعل دراستها أو هندستها أمراً صعباً للغاية. عادة ما تتطلب الطرق التقليدية لتصميم بروتينات جديدة وجود مخطط صلب مسبق الوجود للهدف للعمل عليه، ولكن عندما يكون الهدف عبارة عن خيط متغير الشكل، فإن هذه الطرق غالباً ما تفشل لأنه لا يوجد شكل ثابت للتصميم من أجله.

لقد طور فريق من الباحثين الآن نهجاً جديداً يسمى "GuideFlip" يحل هذه المشكلة عبر تصميم البروتين وشكله في آن واحد. فبدلاً من محاولة فرض تصميم صلب على هدف مرن، يسمح هذا الأسلوب للاثنين بالتطور معاً. استخدم الباحثون هذا النظام لإنشاء بروتينات جديدة كلياً يمكنها الإمساك بالأطراف غير المنظمة لاثنين من البروتينات البشرية المهمة: أحدهما مرتبط بمرض باركنسون، والآخر يتحكم في انقسام الخلايا. وفي الاختبارات المختبرية، حققت التصاميم الجديدة نجاحاً مذهلاً. كما استخدم الفريق نفس التقنية لبناء جسم مضاد متناهي الصغر يمكنه التمييز بين شكلين مختلفين لمستقبل قلبي، بحيث يرتبط فقط بالنسخة النشطة. تُظهر هذه النتائج أنه من الممكن هندسة بروتينات يمكنها صيد وتثبيت أهداف ليس لها شكل ثابت حتى يتم الإمساك بها، مما يفتح الباب لعلاج أمراض كانت في السابق بعيدة المنال عن العلاجات القائمة على البروتين.

كان التحدي الجوهري الذي واجهه الباحثون هو أن البرامج الحاسوبية القياسية لتصميم البروتين تعمل في خطوتين منفصلتين؛ أولاً، تقوم بتوليد هيكل خلفي صلب، وثانياً، تملأ التسلسل الأحماض الأمينية ليتناسب مع ذلك الشكل. يعمل هذا بشكل جيد عندما يكون الهدف جسماً صلباً وغير متغير، ولكن عندما يكون الهدف بروتيناً مرناً وغير منظم، فإن عملية التصميم تنهار. فإذا حاول الكمبيوتر تصميم رابط لشكل لم يوجد بعد، فإنه غالباً ما ينتج تسلسلات لا تشبه البروتينات الطبيعية على الإطلاق، مفضلاً التكتلات الدهنية الكارهة للماء التي ستتكتل معاً في الخلية بدلاً من الارتباط بالهدف. أدرك الباحثون أنه لكي ينجحوا، كانوا بحاجة إلى نظام حيث يمكن للتسلسل والشكل أن يؤثرا على بعضهما البعض باستمرار.

ولتحقيق ذلك، بنوا "GuideFlip"، وهو إطار عمل يستخدم تقنية تسمى "مطابقة التدفق المنفصل الموجه" (guided discrete flow matching). تخيل أنك تحاول إيجاد مسار عبر غابة كثيفة حيث تتحرك الأشجار بينما تسير أنت. بدلاً من رسم خريطة للغابة بأكمل तिचा أولاً ثم السير فيها، يأخذ "GuideFlip" خطوة، ويرى كيف تحركت الأشجار، ثم يقرر الخطوة التالية بناءً على تلك الرؤية الجديدة. في النموذج الحاسوبي، يبدأ النظام بتخمين عشوائي لتسلسل البروتين، ثم يتنبأ بكيفية طي هذا التسلسل والارتباط بالهدف. وبناءً على ذلك التنبؤ، يقوم بتعديل التسلسل قليلاً، ثم يتنبأ بالشكل الجديد مرة أخرى. وتتكرر هذه الدورة، حيث يتطور التسلسل والهيكل المتوقع معاً. جزء رئيسي من النظام هو "الموجه" (guide) الذي يحافظ على بقاء التصميم كبروتين حقيقي قابل للذوبان، مما يمنعه من التحول إلى تلك التكتلات الدهنية عديمة الفائدة. ويستخدم جزء آخر من النظام محرك تنبؤ بالهيكل قوياً لضمان أن الرابط يناسب الهدف بالفعل. ومن خلال الجمع بين هاتين القوتين، يمكن للنظام التنقل في المشهد المعقد للتفاعلات المرنة.

وضع الباحثون هذا الأسلوب قيد الاختبار على هدفين صعبين. كان الأول هو الطرف النهائي لبروتين يسمى "ألفا-سينوكلين" (alpha-synuclein). هذا البروتين مشهور بتكتله في أدمغة المصابين بمرض باركنسون. هذا الطرف غير منظم ولم يسبق رؤيته في شكل ثابت، مما يجعله كابوساً للتصميم التقليدي. طلب الفريق من "GuideFlip" إنشاء رابط لهذا الجزء المحدد دون تقديم أي شكل موجود مسبقاً. قام الكمبيوتر بتوليد آلاف التصاميم، والتي تم تصفيتها للعثور على المرشحين الأكثر واعدية. قام الباحثون بتخليق أفضل المرشحين واختبارهم في المختبر، ووجدوا أن سبعة من أصل سبعة وثلاثين تصميماً نجحت في الارتباط بالهدف. اثنان من هذه التصاميم، سُميا "dnAS15" و"dnAS36"، أظهرا ارتباطاً قوياً. ولإثبات أنهما يرتبطان بالمكان الصحيح، قام الفريق بتقصير البروتين المستهدف، بإزالة الطرف النهائي، ووجدوا أن الروابط لم تعد تلتصق به. كما استخدموا الرنين المغناطيسي النووي، وهي تقنية تتبع حركة الذرات، للتأكد من أن الروابط كانت تمسك بالفعل بالطرف غير المنظم وتثبته في شكل محدد.

تضمن الاختبار الثاني بروتيناً يسمى "RBX1"، والذي يعمل كمفتاح لانقسام الخلايا. الجزء البداية منه غير منظم أيضاً حتى يرتبط بآلة أكبر في الخلية. صمم الباحثون روابط لهذا الجزء البداية المتذبذب. وفي اختبار على طراز المنافسة، قدموا تصاميمهم إلى مجموعة مستقلة للتقييم. وُجد أن اثنين من تصاميمهم، "dnRB1" و"dnRB2"، يرتبطان بقوة بالهدف. وأنتجت جولة لاحقة من التصميم رابطاً أقوى، وهو "dnRB8"، الذي تمسك بقوة قدرها 4.5 نانومولار، وهي وحدة قياس لمدى قوة التصاق جزيئين ببعضهما. وللتأكد من أن هذه الروابط تعمل كما هو منشود، قام الفريق بتغيير أجزاء محددة من الرابط وراقبوا انخفاض قوة الارتباط، مما أكد أن التصميم قد حدد نقاط الاتصال بشكل صحيح.

كما استكشف الفريق ما إذا كان هذا الأسلوب يمكن أن يعمل عندما تكون المرونة في جانب الرابط بدلاً من الهدف. فقد ركزوا على مستقبل في القلب يسمى "مستقبل بيتا-1 الأدريناليني" (beta-1 adrenergic receptor)، والذي يغير شكله عند تلقي إشارة. أرادوا إنشاء جسم مضاد متناهي الصغر، يسمى "نانوبودي" (nanobody)، يمكنه الارتباط بالمستقبل فقط عندما يكون في حالته النشطة، متجاهلاً الحالة غير النشطة. باستخدام هيكل جسم مضاد معروف كدعامة، طلبوا من "GuideFlip" إعادة تصميم الحلقات المرنة التي تتصل بالمستقبل. ولد النظام ستة عشر تصميماً جديداً. وعند اختبارها، تم التعبير عن خمسة عشر منها جيداً في البكتيريا، وارتبط اثنا عشر منها بالمستقبل فقط عندما يتم تنشيطه بواسطة عقار. أحد التصاميم، "NbIC20"، ارتبط بقوة عالية. استخدم الباحثون بعد ذلك المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-electron microscopy)، وهي طريقة تلتقط صوراً ثلاثية الأبعاد للجزيئات بدقة تقترب من المستوى الذري، لرؤية كيفية عمل ذلك بالضبط. وأكدت الصور أن "النانوبودي" المصمم ارتبط بالمستقبل في حالته النشطة، مطابقة النموذج الحاسوبي بدقة مذهلة. وأظهر الهيكل أن الحلقات المرنة للنانوبودي قد اتخذت الشكل المتوقع تماماً، مما أدى إلى تثبيت المستقبل في شكله النشط.

تثبت هذه التجارب أن الفصل القديم بين تصميم الشكل وتصميم التسلسل لم يعد ضرورياً. فمن خلال السماح للاثنين بالتطور معاً، يمكن لـ "GuideFlip" معالجة المشكلات التي كانت تعتبر سابقاً صعبة للغاية، مثل الارتباط ببروتينات ليس لها شكل ثابت أو إنشاء روابط حساسة للتغيرات الطفقة في شكل الهدف. لاحظ الباحثون أيضاً أن طريقتهم أنتجت بروتينات أكثر عرضة للذوبان والاستقرار في الخلية مقارنة بنهج التصميم الأخرى التي تعتمد على تقنيات التحسين الأبسط. وبينما ركزت الدراسة على بروتينات محددة، فإن الإطار العام كافٍ للتطبيق على مشكلات أخرى في التعرف الجزيئي. إن القدرة على تصميم بروتينات يمكنها تثبيت التفاعلات المرنة العابرة تشير إلى عصر جديد في الهندسة الجزيئية، حيث يمكن للعلماء بناء أدوات للإمساك والتحكم في أكثر الأجزاء ديناميكية في الآلات الخلوية.