De novo design of flexible protein interactions with GuideFlip

생물학의 미시 세계에서 생명은 종종 분자 인식이라는 섬세한 게임에 의존합니다. 세포의 일꾼인 단백질은 신호를 보내거나, 구조를 구축하거나, 감염과 싸우기 위해 특정 파트너를 찾아 붙잡아야 합니다. 수십 년 동안 과학자들은 이러한 상호작용 중 다수가 단단한 단백질이 단단한 표적에 완벽하게 들어맞는 '열쇠와 자물쇠' 원리에 의존한다는 것을 이해해 왔습니다. 그러나 자연은 이 단순한 이미지보다 훨씬 더 유동적입니다. 많은 중요한 단백질은 '본질적 무질서(intrinsally disordered)' 상태, 즉 파트너를 만나기 전까지는 고정된 형태를 갖지 않는 특성을 가집니다. 이들은 마치 엉킨 줄과 같아서, 다른 무언가와 결합할 때 비로소 특정한 형태로 딱 들어맞게 됩니다. 이러한 유연성은 세포 성장을 조절하거나 스트레스에 반응하는 것과 같은 복잡한 과업을 수행할 수 있게 해주지만, 동시에 연구하거나 설계하기를 매우 어렵게 만듭니다. 새로운 단백질을 설계하는 전통적인 방법들은 대개 작동하기 위해 기존의 단단한 청사진(표적)을 필요로 합니다. 하지만 표적이 형태가 변하는 줄 형태일 때, 이러한 방법들은 설계할 고정된 형태가 없기 때문에 자주 실패합니다.

연구진은 이제 단백질과 그 형태를 동시에 설계함으로써 이 문제를 해결하는 '가이드플립(GuideFlip)'이라는 새로운 접근 방식을 개발했습니다. 이 방법은 단단한 설계를 유연한 표적에 강제로 끼워 맞추려고 노력하는 대신, 두 요소가 함께 진화하도록 허용합니다. 연구진은 이 시스템을 사용하여 두 가지 중요한 인간 단백질의 무질서한 끝부분을 붙잡을 수 있는 완전히 새로운 단백질을 만들어냈습니다. 하나는 파킨슨병과 관련이 있고, 다른 하나는 세포 분열을 조절하는 단백질입니다. 실험실 테스트에서 이 새로운 설계들은 놀라운 성공을 거두었습니다. 연구진은 또한 동일한 기술을 사용하여 두 가지 서로 다른 형태의 심장 수용체를 구별하여, 활성화된 버전만을 결합하는 아주 작은 항체를 제작했습니다. 이러한 결과는 형태가 잡히기 전까지는 고정된 모양이 없는 표적을 포착하고 안정화할 수 있는 단백질을 설계하는 것이 가능하다는 것을 보여주며, 이는 이전에는 단백질 기반 치료법으로는 손이 닿지 않았던 질병들을 치료할 수 있는 길을 열어줍니다.

연구진이 직면한 핵심 과제는 표준 컴퓨터 프로그램들이 두 개의 별개 단계로 작동한다는 점이었습니다. 먼저, 단단한 백본(backbone) 구조를 생성한 다음, 그 형태에 맞는 아미노산 서열을 채워 넣습니다. 이는 표적이 견고하고 변하지 않는 물체일 때는 잘 작동합니다. 하지만 표적이 흐느적거리는 무질서한 단백질일 경우, 설계 과정이 무너집니다. 컴퓨터가 아직 존재하지 않는 형태를 대상으로 설계를 시도하면, 자연 단백질과는 전혀 닮지 않은 서열, 즉 세포 내에서 결합하는 대신 서로 뭉쳐버릴 기름지고 소수성인 덩어리들을 만들어내는 경우가 많습니다. 연구진은 성공하기 위해서 서열과 구조가 지속적으로 서로에게 영향을 미치는 시스템이 필요하다는 것을 깨달았습니다.

이를 달성하기 위해, 그들은 '가이드 디스크리트 플로우 매칭(guided discrete flow matching)'이라 불리는 기법을 사용하는 프레임워크인 가이드플립을 구축했습니다. 나무들이 당신이 걷는 동안에도 움직이는 울창한 숲속에서 길을 찾는다고 상상해 보십시오. 숲 전체를 먼저 지도화한 다음 걷는 대신, 가이드플립은 한 걸음을 내디디고, 나무들이 어떻게 이동했는지 확인한 다음, 그 새로운 시야를 바탕으로 다음 발걸음을 결정합니다. 컴퓨터 모델에서 시스템은 단백질 서열에 대한 무작위 추측에서 시작합니다. 그런 다음 그 서열이 어떻게 접히고 표적에 결합할지를 예측합니다. 그 예측을 바탕으로 서열을 약간 조정하고, 다시 새로운 형태를 예측합니다. 이 순환 과정을 통해 서열과 예측된 구조는 함께 진화합니다. 시스템의 핵심 부분은 설계가 실제 용해 가능한 단백질처럼 보이도록 유지하여, 쓸모없는 기름진 덩어리로 변하는 것을 방지하는 '가이드(guide)'입니다. 또 다른 부분은 바인더가 실제로 표적에 잘 맞는지 확인하기 위해 강력한 구조 예측 엔진을 사용합니다. 이 두 가지 힘을 결합함으로써, 시스템은 복잡한 유연한 상호작용의 지형을 헤쳐 나갈 수 있습니다.

연구진은 이 방법을 두 가지 까다로운 표적에 테스트했습니다. 첫 번째는 알파-시뉴클레인(alpha-synuclein)이라는 단백질의 꼬리 부분입니다. 이 단백질은 파킨슨병 환자의 뇌에서 뭉치는 것으로 유명합니다. 꼬리 부분은 무질서하며 고정된 형태로 관찰된 적이 없기에, 전통적인 설계 방식으로는 악몽과도 같은 대상입니다. 연구진은 가이드플립에게 사전의 존재하는 형태 없이 이 특정 영역에 결합하는 바인더를 만들라고 요청했습니다. 컴퓨터는 수천 개의 설계를 생성했고, 그중 가장 유망한 후보들을 걸러냈습니다. 연구진은 상위 후보들을 합성하여 실험실에서 테스트했습니다. 그 결과, 37개의 설계 중 7개가 표적에 성공적으로 결합했습니다. 이 중 dnAS15와 dnAS36이라는 이름의 두 설계는 강력한 결합력을 보였습니다. 바인더가 올바른 위치에 결합하고 있음을 증명하기 위해, 연구진은 표적 단백질을 짧게 잘라 꼬리 부분을 제거했으며, 그 결과 바인더가 더 이상 부착되지 않음을 확인했습니다. 또한 원자들의 움직임을 추적하는 기술인 핵자기 공명(NMR)을 사용하여, 바인더가 실제로 무질서한 꼬리를 붙잡아 특정한 형태로 안정화시키고 있음을 확인했습니다.

두 번째 테스트는 세포 분열의 스위치 역할을 하는 RBX1이라는 단백질을 대상으로 했습니다. 이 단백질의 시작 부분 역시 세포 내의 더 큰 기계와 결합하기 전까지는 무질서한 상태입니다. 연구진은 이 흐느적거리는 시작 부분에 결합하는 바인더를 설계했습니다. 경쟁 방식의 테스트에서, 연구진은 자신들의 설계를 평가받기 위해 독립적인 그룹에 제출했습니다. 그들의 설계 중 dnRB1과 dnRB2가 표적에 단단히 결합한다는 것이 밝혀졌습니다. 이후의 설계 라운드에서는 훨씬 더 강력한 바인더인 dnRB8이 제작되었으며, 이는 두 분자가 얼마나 끈끈하게 붙어 있는지를 나타내는 척도인 4.5 나노몰(nanomolar)의 친화력을 보였습니다. 바인더가 의도한 대로 작동하는지 확인하기 위해, 연구진은 바인더의 특정 부분을 돌연변이 시켰고 결합력이 떨어지는 것을 관찰함으로써, 설계가 접촉 지점을 정확히 식별했음을 확인했습니다.

연구진은 유연성이 표적이 아닌 바인더 쪽에 있을 때도 이 방법이 작동할 수 있는지 탐구했습니다. 그들은 심장의 베타-1 아드레날린 수용체(beta-1 adrenergic receptor)에 집중했는데, 이 수용체는 신호를 받을 때 형태가 변합니다. 그들은 수용체가 '활성(on)' 상태일 때만 결합하고 '비활성(off)' 상태는 무시하는 아주 작은 항체, 즉 나노바디(nanobody)를 만들고자 했습니다. 알려진 항체 구조를 스캐폴드(scaffold)로 사용하여, 연구진은 가이드플립에게 수용체와 접촉하는 유연한 루프(loop)를 재설계하도록 요청했습니다. 시스템은 16개의 새로운 설계를 생성했습니다. 테스트 결과, 15개가 박테리아에서 잘 발현되었고, 12개는 약물에 의해 활성화되었을 때만 수용체에 결합했습니다. NbIC20이라는 하나의 설계는 높은 친화력으로 결합했습니다. 연구든은 분자 수준의 근사적 해상도로 3D 이미지를 찍는 기술인 저온 전자 현미경(cryo-electron microscopy)을 사용하여, 이것이 정확히 어떻게 작동하는지 살펴보았습니다. 이미지는 설계된 나노바디가 활성 상태의 수용체에 결합한다는 것을 확인시켜 주었으며, 컴퓨터 모델과 놀라울 정도로 일치했습니다. 구조를 보면 나노바디의 유연한 루프가 예측된 정확한 형태를 취하여 수용체를 활성 상태로 고정하고 있음을 보여주었습니다.

이 실험들은 형태를 설계하는 것과 서열을 설계하는 것 사이의 기존의 분리가 더 이상 필요하지 않다는 것을 입증합니다. 두 요소를 함께 진화하게 함으로써, 가이드플립은 고정된 형태가 없는 단백질에 결합하거나 표적의 미세한 형태 변화에 민감한 바인더를 만드는 것과 같이 이전에는 너무 어렵다고 여겨졌던 문제들을 다룰 수 있습니다. 연구진은 또한 자신들의 방법이 단순한 최적화 기법에 의존하는 다른 설계 방식들에 비해 더 용해도가 높고 세포 내에서 안정적인 단백질을 생성한다는 점을 언급했습니다. 이 연구는 특정 단백질에 초점을 맞추었지만, 이 프레임워크는 다른 분자 인식 문제에도 적용될 수 있을 만큼 일반적입니다. 찰나의 유연한 상호작용을 포착하고 안정화할 수 있는 단백질을 설계할 수 있는 능력은, 과학자들이 세포 기계의 가장 역동적인 부분들을 붙잡고 제어할 수 있는 분자 공학의 새로운 시대를 암시합니다.