De novo design of flexible protein interactions with GuideFlip

生物学の微視的な世界において、生命はしばしば分子認識という繊細なゲームに依存しています。細胞の働き手であるタンパク質は、信号を送ったり、構造を構築したり、感染症と戦ったりするために、特定のパートナーを見つけ出し、それを掴まなければなりません。数十年にわたり、科学者たちはこれらの相互作用の多くが「鍵と錠前」の原理に基づいていることを理解してきました。そこでは、硬いタンパク質が硬い標的に完璧に適合します。しかし、自然界はこの単純なイメージよりもはるかに流動的です。多くの重要なタンパク質は本質的に無秩序（intrinsically disordered）であり、パートナーに出会うまで固定された形状を持ちません。それらは絡まった紐のようなものであり、他のものに結合した瞬間に初めて特定の形へとパッと整います。この柔軟性によって、細胞の成長を制御したりストレスに応答したりといった複雑なタスクを実行できるのですが、同時に研究や設計を極めて困難なものにもしています。新しいタンパク質を設計するための従来の手法は通常、対象となるものの既にある剛直なブループリント（設計図）を必要とします。ターゲットが形を変える紐状のものである場合、固定された形が存在しないため、これらの手法は失敗することがよくあります。

研究チームは現在、「GuideFlip」と呼ばれる新しいアプローチを開発しており、これはタンパク質とその形状を同時に設計することでこの問題を解決します。設計したものを柔軟なターゲットに無理やり押し付けるのではなく、両者が共に進化できるようにするのです。研究者たちはこのシステムを使用して、パーキンソン病に関与するタンлоルンの一つと、細胞分裂を制御するものの一つを含む、二つの重要なヒトタンパク質の無秩序な末端を捕らえることができる全く新しいタンパク質を作り出しました。実験室でのテストでは、これらの新しい設計は驚くべき成功を収めました。また、チームはこの技術を用いて、心臓の受容体の異なる二つの形状を識別し、活性化しているバージョンにのみ結合する小さな抗体も構築しました。これらの結果は、捉えられるまでは決まった形を持たないターゲットを捕捉し、安定させることが可能であることを示しており、これまでタンパク質ベースの治療法では手の届かなかった疾患への扉を開いています。

研究者が直面した核心的な課題は、標準的なコンピュータプログラムによるタンパク質設計が、二つの別々のステップで動作することでした。まず、剛直なバックボーン構造を生成し、次にその形状に合わせてアミノ酸配列を埋めるという手順です。これはターゲットが固定的で不変の物体である場合にはうまく機能します。しかし、ターゲットが無秩序で動きやすいタンプリンの場合、設計プロセスは崩壊してしまいます。もしコンピュータがまだ存在していない形に対してバインダー（結合体）を設計しようとすると、天然のタンパク質とは似ても似つかない配列を作成してしまうことが多く、セル内でターゲットに結合する代わりに脂っこい疎水性の塊となって集まってしまうような配列を選んでしまうのです。研究者たちは、成功するためには、配列と構造が継続的に互いに影響を与え合うシステムが必要であることに気づきました。

これを実現するために、彼らは「誘導型離散フローマッチング（guided discrete flow matching）」と呼ばれる手法を用いたフレームワーク、GuideFlipを構築しました。歩を進めるにつれて木々が動いていく密な森の中を通る道を探す場面を想像してみてください。森全体を先にマッピングしてから歩き出すのではなく、GuideFlipは一歩進み、木々がどのように移動したかを確認し、その新しい景色に基づいて次のステップを決定します。コンピュータモデル内では、システムはランパク質の配列のランダムな推測から始まります。次に、その配列がどのように折り畳まれ、ターゲットに結合するかを予測します。その予測に基づき、配列をわずかに調整し、再び新しい形状を予測します。このサイクルが繰り返され、配列と予測される構造が共に進化していきます。システムの鍵となるのは、デザインが実際の可溶性の高いタンパク質のように見えるように維持する「ガイド」であり、これにより役に立たない油ぎった塊になるのを防いでいます。もう一つの部分は、強力な構造予測エンジンを使用しており、バインダーが実際にターゲットにフィットすることを保証します。これら二つの力を組み合わせることで、システムは複雑な柔軟な相互作用のランドスケープをナビゲートすることができるのです。

研究者たちはこの方法を二つの困難なターゲットに対して試しました。一つ目は、アルファシヌクレインと呼ばれるタンパク質のテイルエンド（尾部）です。このタンパク質は、パーキンソン病患者の脳内で凝集することで有名です。そのテイルエンドは無秩序であり、固定された形状として観察されたことは一度もありません。そのため、従来の設計にとっては悪夢のような存在です。チームは、あらかじめ存在する形状を指定することなく、この特定領域に対するバインダーを作るようGuideFlipに命じました。コンピュータは数千のデザインを生成し、その後最も有望な候補を選ぶためにフィルタリングを行いました。研究者たちはトップの候補を合成し、ラボでテストしました。その結果、三十七のデザインのうち七つがターゲットへの結合に成功しました。中でもdnAS15とdnAS36という名前の二つは、強い結合を示しました。これらが正しい場所に結合していることを証明するために、チームはターゲットとなるタンパク質を短縮してテイルエンドを除去しましたが、するとバインダーは結合しなくなりました。また、原子の動きを追跡する技術である核磁気共鳴（NMR）を用い、バインダーが確かに無秩序なテイルを掴み、それを特定の形状へと安定させていることを確認しました。

二つ目のテストは、細胞分裂のスイッチとして機能するRBX1と呼ばれるタンパク質に関するものでした。その冒頭の部分も、細胞内のより大きな機械に結合するまで無秩序な状態にあります。研究者たちは、このぐにゃぐにゃとした開始部分に対するバインダーを設計しました。コンペティション形式のテストにおいて、彼らは独立したグループに自身のデザインを提出し評価を受けました。彼らのデザインのうち、dnRB1とdnRB2の二つがターゲットに強く結合することが判明しました。続く設計ラウンドでは、さらに強力なバインダーであるdnRB8が作られ、それは4.5ナノモーラーという親和性（二つの分子がいかに強く結びつくかの尺度）を持って保持されました。これらのバインダーが意図通りに機能していることを確実にするため、チームはバインダーの特定の部分を変異させ、結合強度が低下することを確認することで、設計が正しく接触点を見極めていることを確かめました。

チームはまた、柔軟性がターゲット側ではなくバインダー側にある場合に、この方法が機能するかどうかについても調査しました。彼らは、信号を受けると形が変わる心臓のベータ1アドレナリン受容体に焦点を当てました。彼らは、受容体が活性化した「オン」の状態のときのみ結合し、不活性な「オフ」の状態は無視する、非常に小さな抗体（ナノボディ）を作りたいと考えました。既知の抗体構造を足場として使用し、受け側に接する柔軟なループを再設計するようにGuideFlipに指示を出しました。システムは十六のデザインを生成しました。テストの結果、うち十五個は細菌の中で適切に発現し、十二個は薬物によって活性化されたときにのみ受容体に結合しました。一つのデザインであるNbIC20は、高い親和性で結合しました。研究者たちはその後、クライオ電子顕微鏡（分子を近原子解像度で撮影する手法）を使用して、それが具体的にどのように機能しているかを調べました。画像により、設計されたナノボディが活性状態の受容体に結合していることが確認され、コンピュータモデルと驚くほど正確に一致していました。その構造からは、ナノボディの柔軟なループが予測通りの形状を採用し、受容体を活性状態にロックしている様子が見て取れました。

これらの実験は、形状の設計と配列の設計との間の古い分離がはや必要ではないことを証明しています。両者を共に進化させることにより、GuideFlipは、固定された形状を持たないタンパク質への結合や、ターゲットの微妙な形態変化に敏感なバインダーの作成など、以前は困難だと考えられていた問題に取り組むことができます。研究者たちはまた、彼らの手法が、より単純な最適化技術に頼る他の設計アプローチと比較して、細胞内で溶解性と安定性が高いタンパク質を生み出したことも指摘しています。今回の研究は特定のタンパク質に焦点を当てたものですが、このフレームワークは他の分子認識の問題にも適用可能なほど汎用性に富んでいます。儚く柔軟な相互作用を捕捉・制御できるタンパク質を設計できる能力は、科学者が細胞機構の最もダイナミックな部分を捕まえ、制御するためのツールを構築できる、分子工学の新時代を示唆しています。