De novo design of flexible protein interactions with GuideFlip

जीव विज्ञान की सूक्ष्म दुनिया में, जीवन अक्सर आणविक पहचान (molecular recognition) के एक नाजुक खेल पर निर्भर करता है। प्रोटीन, जो कोशिका के कार्यवाहक होते हैं, उन्हें संकेत भेजने, संरचनाएं बनाने या संक्रमणों से लड़ने के लिए विशिष्ट भागीदारों को खोजने और उन्हें पकड़ने की आवश्यकता होती है। दशकों से, वैज्ञानिक समझते आए हैं कि इनमें से कई अंतःक्रियाएं एक 'ताला-और-चाबी' के सिद्धांत पर निर्भर करती हैं, जहाँ एक कठोर प्रोटीन एक कठोर लक्ष्य में पूरी तरह से फिट बैठता है। हालाँकि, प्रकृति इस सरल छवि की तुलना में कहीं अधिक तरल है। कई महत्वपूर्ण प्रोटीन स्वाभाविक रूप से अव्यवस्थित (intrinsically disordered) होते हैं, जिसका अर्थ है कि जब तक वे अपने साथी से नहीं मिलते, तब तक उनका कोई निश्चित आकार नहीं होता। वे उलझे हुए धागों की तरह होते हैं जो किसी दूसरी चीज़ से जुड़ने के बाद ही एक विशिष्ट रूप ले लेते हैं। यह लचीलापन उन्हें जटिल कार्य करने की अनुमति देता है, जैसे कि कोशिका वृद्धि को नियंत्रित करना या तनाव के प्रति प्रतिक्रिया देना, लेकिन यह उन्हें अध्ययन या इंजीनियर करने के लिए अविश्वसनीय रूप से कठिन भी बनाता है। नए प्रोटीन डिजाइन करने के तरीके आमतौर पर इसके लिए एक पूर्व-मौजूद, कठोर ब्लूप्रिंट की आवश्यकता रखते हैं जिस पर काम किया जा सके। जब लक्ष्य एक आकार बदलने वाला धागा हो, तो ये तरीके अक्सर विफल हो जाते हैं क्योंकि डिजाइन करने के लिए कोई निश्चित आकार मौजूद नहीं होता।

शोधकर्ताओं के एक दल ने अब GuideFlip नामक एक नया दृष्टिकोण विकसित किया है जो इस समस्या को हल करता है: यह प्रोटीन और उसके आकार को एक साथ डिजाइन करता है। एक लचीले लक्ष्य पर एक कठोर डिजाइन थोपने के बजाय, यह विधि दोनों को एक साथ विकसित होने की अनुमति देती है। शोधकर्ताओं ने इस प्रणाली का उपयोग उन नए प्रोटीनों को बनाने के लिए किया जो मानव प्रोटीन के दो महत्वपूर्ण सिरों को पकड़ सकते हैं: एक जो पार्किंसंस रोग में शामिल है और दूसरा जो कोशिका विभाजन को नियंत्रित करता है। प्रयोगशाला परीक्षणों में, नए डिजाइन आश्चर्यजनक सफलता के साथ काम करते दिखे। टीम ने उसी तकनीक का उपयोग हृदय रिसेप्टर के दो अलग-अलग आकारों के बीच अंतर करने वाले एक छोटे एंटीबॉडी को बनाने के लिए भी किया, जो केवल सक्रिय संस्करण से जुड़ता है। ये परिणाम दर्शाते हैं कि ऐसे प्रोटीन इंजीनियर करना संभव है जो उन लक्ष्यों को पकड़ और स्थिर कर सकते हैं जिनका पकड़ में आने तक कोई निश्चित आकार नहीं होता, जिससे उन बीमारियों के उपचार का मार्ग प्रशन होता है जो पहले प्रोटीन-आधारित उपचारों के लिए पहुंच से बाहर थीं।

मुख्य चुनौती जो शोधकर्ताओं के सामने आई वह यह थी कि प्रोटीन डिजाइन के लिए मानक कंप्यूटर प्रोग्राम दो अलग-अलग चरणों में काम करते हैं। पहले, वे एक कठोर बैकबोन संरचना उत्पन्न करते हैं, और दूसरे, वे उस आकार में फिट होने के लिए अमीनो एसिड अनुक्रम (sequence) भरते हैं। यह तब अच्छी तरह काम करता है जब लक्ष्य एक ठोस, अपरिवर्तनीय वस्तु हो। लेकिन जब लक्ष्य एक ढीला, अव्यवस्थित प्रोटीन होता है, तो डिजाइन प्रक्रिया टूट जाती है। यदि कंप्यूटर उस आकार के लिए बाइंडर डिजाइन करने की कोशिश करता है जो अभी तक अस्तित्व में ही नहीं है, तो यह अक्सर ऐसे अनुक्रम बनाता है जो प्राकृतिक प्रोटीनों जैसे बिल्कुल नहीं दिखते, और वे वसायुक्त, हाइड्रोफोबिक गुच्छों (greasy, hydrophobic clumps) को प्राथमिकता देते हैं जो कोशिका में लक्ष्य से जुड़ने के बजाय आपस में ही गुच्छे बना लेंगे। शोधकर्ताओं ने महसूस किया कि सफल होने के लिए, उन्हें एक ऐसी प्रणाली की आवश्यकता थी जहाँ अनुक्रम और संरचना निरंतर एक-दूसरे को प्रभावित कर सकें।

इसे प्राप्त करने के लिए, उन्होंने Guide ही 'गाइडेड डिस्क्रीट फ्लो मैचिंग' (guided discrete flow matching) नामक एक तकनीक का उपयोग करने वाला एक ढांचा, GuideFlip बनाया। कल्पना कीजिए कि आप एक घने जंगल के माध्यम से रास्ता खोजने की कोशिश कर रहे हैं जहाँ आप चलते समय पेड़ हिल रहे हैं। पूरे जंगल का पहले मानचित्रण करने और फिर चलने के बजाय, GuideFlip एक कदम उठाता है, देखता है कि पेड़ कैसे खिसके हैं, और फिर उस नए दृश्य के आधार पर अगला कदम तय करता है। कंप्यूटर मॉडल में, प्रणाली प्रोटीन अनुक्रम का एक यादृच्छिक अनुमान (random guess) से शुरू होती है। फिर यह भविष्यवाणी करती है कि वह अनुक्रम लक्ष्य के साथ कैसे मुड़ेगा और जुड़ेगा। उस भविष्यवाणी के आधार पर, यह अनुक्रम को थोड़ा समायोजित करती है, फिर नए आकार की फिर से भविष्यवाणी करती है। यह चक्र दोहराया जाता है, जिसमें अनुक्रम और अनुमानित संरचना एक साथ विकसित होते हैं। प्रणाली का एक प्रमुख हिस्सा एक "गाइड" है जो यह सुनिश्चित करता है कि डिजाइन एक वास्तविक, घुलनशील प्रोटीन जैसा दिखे, जिससे इसे उन बेकार, वसायुक्त गुच्छों में बदलने से रोका जा सके। प्रणाली का एक अन्य हिस्सा एक शक्तिशाली संरचना-भविष्यवाणी इंजन का उपयोग करता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि बाइंडर वास्तव में लक्ष्य में फिट बैठता है। इन दो बलों को मिलाकर, प्रणाली लचीली अंतःक्रियाओं के जटिल परिदृश्य में नेविगेट कर सकती है।

शोधकर्ताओं ने इस पद्धति को दो कठिन लक्ष्यों पर परखा। पहला अल्फा-सिन्यूक्लिन (alpha-synuclein) नामक प्रोटीन का सिरा था। यह प्रोटीन पार्किंसंस रोग से पीड़ित लोगों के मस्तिष्क में गुच्छे बनाने के लिए प्रसिद्ध है। इसका सिरा अव्यवस्थित है और इसे कभी भी एक निश्चित आकार में नहीं देखा गया है, जो पारंपरिक डिजाइन के लिए एक दुस्वप्न जैसा है। टीम ने GuideFlip से बिना किसी पूर्व-मौजूद आकार के इस विशिष्ट क्षेत्र के लिए एक बाइंडर बनाने को कहा। कंप्यूटर ने हजारों डिजाइन तैयार किए, जिन्हें सबसे आशाजनक उम्मीदवारों को खोजने के लिए फ़िल्टर किया गया। शोधकर्ताओं ने शीर्ष उम्मीदवारों को संश्लेषित किया और प्रयोगशाला में उनका परीक्षण किया। उन्होंने पाया कि तीस में से सात डिजाइनों ने सफलतापूर्वक लक्ष्य से जुड़ना सफलतापूर्वक किया। इनमें से दो, जिन्हें dnAS15 और dnAS36 नाम दिया गया, ने मजबूत बंधन दिखाया। यह साबित करने के लिए कि वे सही जगह पर बंध रहे हैं, टीम ने लक्ष्य प्रोटीन को छोटा कर दिया, पूंछ के हिस्से को हटा दिया, और पाया कि बाइंडर अब उससे नहीं जुड़े। उन्होंने न्यूक्लियर मैग्नेटिक रेजोनेंस (NMR) का भी उपयोग किया, जो परमाणुओं की गति को ट्रैक करने की एक तकनीक है, ताकि पुष्टि की जा सके कि बाइंडर वास्तव में अव्यवस्थित पूंछ को पकड़ रहे थे और उसे एक विशिष्ट आकार में स्थिर कर रहे थे।

दूसरे परीक्षण में RBX1 नामक एक प्रोटीन शामिल था, जो कोशिका विभाजन के लिए एक स्विच के रूप में कार्य करता है। इसका शुरुआती हिस्सा भी तब तक अव्यवस्थित रहता है जब तक कि यह कोशिका में एक बड़ी मशीन से नहीं जुड़ जाता। शोधकर्ताओं ने इस ढीले शुरुआती हिस्से के लिए बाइंडर डिजाइन किए। एक प्रतियोगिता-शैली के परीक्षण में, उन्होंने अपने डिजाइनों को मूल्यांकन के लिए एक स्वतंत्र समूह को सौंपा। उनके दो डिजाइनों, dnRB1 और dnRB2, को पाया गया कि वे लक्ष्य से मजबूती से जुड़ते हैं। एक बाद के डिजाइन दौर ने एक और भी मजबूत बाइंडर, dnRB8, का उत्पादन किया, जिसने 4.5 नैनोमोलर की आत्मीयता (affinity) के साथ पकड़ बनाई, जो यह मापता है कि दो अणु कितनी मजबूती से चिपकते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि उनके बाइंडर इच्छित रूप से काम कर रहे हैं, टीम ने बाइंडर के विशिष्ट हिस्सों को उत्परिवर्तित (mutate) किया और बंधन शक्ति में गिरावट देखी, जिससे पुष्टि हुई कि डिजाइन ने संपर्क बिंदुओं की सही पहचान की थी।

टीम ने यह भी पता लगाया कि क्या यह विधि तब काम कर सकती है जब लचीलापन बाइंडर की ओर हो न कि लक्ष्य की ओर। उन्होंने हृदय में एक रिसेप्टर पर ध्यान केंद्रित किया जिसे बीटा-1 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर (beta-1 adrenergic receptor) कहा जाता है, जो आकार बदलता है जब उसे एक संकेत प्राप्त होता है। वे एक छोटा एंटीबॉडी, जिसे नैनोबॉडी कहा जाता है, बनाना चाहते थे जो केवल तभी रिसेप्टर से जुड़े जब वह सक्रिय, "ऑन" अवस्था में हो, और निष्क्रिय "ऑफ" अवस्था को अनदेखा करे। एक ज्ञात एंटीबॉडी संरचना को स्कैफोल्ड के रूप में उपयोग करते हुए, उन्होंने GuideFlip से उन लचीले लूप्स को पुनर्गठित करने के लिए कहा जो रिसेप्टर के संपर्क में आते हैं। प्रणाली ने सोलह नए डिजाइन उत्पन्न किए। परीक्षण करने पर, उनमें से पंद्रह बैक्टीरिया में अच्छी तरह व्यक्त हुए, और बारह ने रिसेप्टर से केवल तभी बंधा जब उसे एक दवा द्वारा सक्रिय किया गया था। एक डिजाइन, NbIC20, उच्च आत्मीयता के साथ बंधा। शोधकर्ताओं ने यह देखने के लिए कि यह कैसे काम करता है, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (cryo-electron microscopy) का उपयोग किया, जो अणुओं की परमाणु-स्तर के करीब 3D तस्वीरें लेता है। छवियों ने पुष्टि की कि डिजाइन किया गया नैनोबॉडी सक्रिय अवस्था में रिसेप्टर से बंधा हुआ था, जो कंप्यूटर मॉडल के साथ उल्लेखनीय सटीकता से मेल खाता था। संरचना ने दिखाया कि नैनोबॉडी के लचीले लूप ने ठीक वही आकार अपनाया था जैसा कि डिजाइन में अनुमान लगाया गया था, जिससे रिसेप्टर सक्रिय रूप में लॉक हो गया।

ये प्रयोग प्रदर्शित करते हैं कि आकार डिजाइन करने और अनुक्रम डिजाइन करने के बीच का पुराना अलगाव अब आवश्यक नहीं है। दोनों को एक साथ विकसित होने देकर, GuideFlip उन समस्याओं से निपट सकता है जिन्हें पहले बहुत कठिन माना जाता था, जैसे कि उन प्रोटीनों से जुड़ना जिनका कोई निश्चित आकार नहीं होता या ऐसे बाइंडर बनाना जो लक्ष्य के रूप में के सूक्ष्म परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील हों। शोधकर्ताओं ने यह भी नोट किया कि उनकी विधि ने अन्य डिजाइन दृष्टिकोणों की तुलना में अधिक घुलनशील और स्थिर प्रोटीन बनाए जो सरल अनुकूलन तकनीकों पर निर्भर करते हैं। हालांकि यह अध्ययन विशिष्ट प्रोटीनों पर केंद्रित था, यह ढांचा अन्य आणविक पहचान समस्याओं पर लागू होने के लिए पर्याप्त सामान्य है। फ्लेक्सिबल इंटरैक्शन को पकड़ने और स्थिर करने वाले प्रोटीन डिजाइन करने की क्षमता आणविक इंजीनियरिंग के एक नए युग का सुझाव देती है, जहाँ वैज्ञानिक कोशिकीय मशीनरी के सबसे गतिशील हिस्सों को पकड़ने और नियंत्रित करने के उपकरण बना सकते हैं।