De novo design of flexible protein interactions with GuideFlip

In der mikroskopischen Welt der Biologie hängt das Leben oft von einem empfindlichen Spiel der molekularen Erkennung ab. Proteine, die Arbeitspferde der Zelle, müssen ihre spezifischen Partner finden und greifen, um Signale zu senden, Strukturen aufzubauen oder Infektionen zu bekämpfen. Jahrzehntelang verstanden Wissenschaftler, dass viele dieser Interaktionen auf einem Schlüssel-Schloss-Prinzip beruhen, bei dem ein starres Protein perfekt in ein starres Ziel passt. Doch die Natur ist weitaus fließender, als dieses einfache Bild vermuten lässt. Viele entscheidende Proteine sind intrinsisch ungeordnet, was bedeutet, dass sie keine feste Form besitzen, bis sie auf ihren Partner treffen. Sie sind wie verhedderte Fäden, die erst in eine spezifische Form schnappen, sobald sie an etwas anderes binden. Diese Flexibilität ermöglicht es ihnen, komplexe Aufgaben zu erfüllen, wie etwa das Zellwachstum zu regulieren oder auf Stress zu reagieren, aber sie macht sie auch unglaublich schwierig zu untersuchen oder zu konstruieren. Traditionelle Methoden zur Entwicklung neuer Proteine erfordern normalerweise einen bereits existierenden, starren Bauplan des Ziels, um an diesem zu arbeiten. Wenn das Ziel ein formveränderlicher Faden ist, versagen diese Methoden oft, da es keine feste Form gibt, für die man entwerfen könnte.

Ein Forschungsteam hat nun einen neuen Ansatz namens GuideFlip entwickelt, der dieses Problem löst, indem es das Protein und seine Form gleichzeitig entwirft. Anstatt zu versuchen, ein starres Design auf ein flexibles Ziel zu erzwingen, ermöglicht diese Methode, dass sich beide gemeinsam entwickeln. Die Forscher nutzten dieses System, um völlig neue Proteine zu erschaffen, die die ungeordneten Enden zweier wichtiger menschlicher Proteine greifen können: eines, das mit Parkinson involviert ist, und eines, das die Zellteilung steuert. In Labortests funktionierten die neuen Designs mit überraschendem Erfolg. Das Team nutzte dieselbe Technik auch, um einen winzigen Antikörper zu bauen, der zwischen zwei verschiedenen Formen eines Herzrezeptors unterscheiden kann, indem er nur an die aktive Version bindet. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, Proteine zu konstruieren, die Ziele einfangen und stabilisieren können, die keine feste Form haben, bis sie gefangen werden, was die Tür für die Behandlung von Krankheiten öffnet, die zuvor für proteingestützte Therapien unerreichbar waren.

Die zentrale Herausforderung, der die Forscher gegenüberstanden, war, dass Standard-Computerprogramme für das Proteindesign in zwei separaten Schritten operieren. Zuerst generieren sie eine starre Rückgratstruktur und zweitens füllen sie die Aminosäuresequenz aus, um in diese Form zu passen. Dies funktioniert gut, wenn das Ziel ein fester, unveränderlicher Gegenstand ist. Aber wenn das Ziel ein schlaksiges, ungeordnetes Protein ist, bricht der Designprozess zusammen. Wenn der Computer versucht, einen Binder für eine Form zu entwerfen, die noch gar nicht existiert, erstellt er oft Sequenzen, die den natürlichen Proteinen kaum ähneln und stattdessen eher fettige, hydrophobe Klumpen bevorzugen, die in einer Zelle zusammenklumpen würden, anstatt an ein Ziel zu binden. Die Forscher erkannten, dass sie ein System benötigten, in dem die Sequenz und die Struktur sich kontinuierlich gegenseitig beeinflussen konnten.

Um dies zu erreichen, bauten sie GuideFlip, ein Framework, das eine Technik namens „guided discrete flow matching“ verwendet. Stellen Sie sich vor, Sie versuchen, einen Pfad durch einen dichten Wald zu finden, in dem sich die Bäume bewegen, während Sie gehen. Anstatt zuerst den ganzen Wald zu kartieren und dann zu gehen, macht GuideFlip einen Schritt, sieht, wie sich die Bäume verschoben haben, und entscheidet dann den nächsten Schritt basierend auf dieser neuen Sichtweise. Im Computermodell beginnt das System mit einer zufälligen Vermutung einer Proteinsequenz. Es sagt dann voraus, wie diese Sequenz falten und an das Ziel binden würde. Basierend auf dieser Vorhersage passt es die Sequenz leicht an, berechnet dann die neue Form erneut. Dieser Zyklus wiederholt sich, wobei die Sequenz und die vorhergesagte Struktur gemeinsam evolvieren. Ein wesentlicher Teil des Systems ist ein „Guide“, der sicherstellt, dass das Design wie ein echtes, lösliches Protein aussieht und verhindert, dass es in jene nutzlosen, fettigen Klumpen verwandelt. Ein anderer Teil des Systems nutzt eine leistungsstarke Strukturvorhersage-Engine, um sicherzustellen, dass der Binder tatsächlich an das Ziel passt. Durch die Kombination dieser beiden Kräfte kann das System durch die komplexe Landschaft flexibler Interaktionen navigieren.

Die Forscher unterzogen diese Methode zwei schwierigen Zielen einem Test. Das erste war das Ende eines Proteins namens Alpha-Synuclein. Dieses Protein ist berüchtigt dafür, sich in den Gehirnen von Menschen mit Parkinson zusammenzuklumpen. Das Ende des Proteins ist ungeordnet und wurde noch nie in einer festen Form beobachtet, was es zu einem Albtraum für das traditionelle Design macht. Das Team bat GuideFlip, einen Binder für diese spezifische Region zu entwerfen, ohne eine vor existierende Form anzugeben. Der Computer generierte tausende Designs, die dann gefiltert wurden, um die vielversprechendsten Kandidaten zu finden. Die Forscher synthetisierten die besten Kandidaten und testeten sie im Labor. Sie fanden heraus, dass sieben von siebenunddreißig Designs erfolgreich an das Ziel banden. Zwei dieser Designs, benannt als dnAS15 und dnAS36, zeigten eine starke Bindung. Um zu beweisen, dass sie an die richtige Stelle binden, verkürzte das Team das Zielprotein, entfernte das Ende, und stellte fest, dass die Binder sich nicht mehr anhefteten. Sie verwendeten auch Kernspinresonanzspektroskopie, eine Technik, die die Bewegung von Atomen verfolgt, um zu bestätigen, dass die Binder tatsächlich das ungeordnete Ende packten und es in eine spezifische Form stabilisierten.

Der zweite Test beinhaltete ein Protein namens RBX1, das als Schalter für die Zellteilung fungiert. Sein Anfangsbereich ist ebenfalls ungeordnet, bis er an eine größere Maschinerie in der Zelle bindet. Die Forscher entwarfen Binder für diesen wackeligen Startabschnitt. In einem wettbewerbsähnlichen Test reichten sie ihre Designs bei einer unabhängigen Gruppe zur Bewertung ein. Zwei ihrer Designs, dnRB1 und dnRB2, wurden gefunden, fest an das Ziel zu binden. Eine darauffolgende Designrunde produzierte einen noch stärkeren Binder, dnRB8, der mit einer Affinität von 4,5 Nanomolar hielt – ein Maß dafür, wie fest zwei Moleküle zusammenkleben. Um sicherzustellen, dass diese Binder wie beabsichtigt funktionierten, mutierten das Team spezifische Teile des Binders und beobachtete, wie die Bindungsstärke sank, was bestätigte, dass das Design die Kontaktpunkte korrekt identifiziert hatte.

Das Team untersuchte auch, ob diese Methode funktionieren könnte, wenn die Flexibilität auf der Seite des Binders statt auf der Seite des Ziels liegt. Sie konzentrierten sich auf einen Rezeptor im Herzen, den Beta-1-Adrenorezeptor, der seine Form ändert, wenn er ein Signal erhält. Sie wollten einen winzigen Antikörper, einen sogenannten Nanobody, erschaffen, der nur dann an den Rezeptor bindet, wenn dieser sich im aktiven „An“-Zustand befindet, und den inaktiven „Aus“-Zustand ignoriert. Unter Verwendung einer bekannten Antikörperstruktur als Gerüst bat das Team GuideFlip, die flexiblen Loops neu zu gestalten, die mit dem Rezeptor in Kontakt treten. Das System generierte sechzehn neue Designs. Bei Tests zeigten sich sechzehn davon gut in Bakterien exprimierbar, und zwölf von ihnen banden an den Rezeptor, wenn dieser durch ein Medikament aktiviert wurde. Ein Design, NbIC20, band mit hoher Affinität. Die Forscher nutzten dann Kryo-Elektronenmikroskopie, eine Methode, die 3D-Bilder von Molekülen mit nahezu atomarer Auflösung erstellt, um genau zu sehen, wie es funktionierte. Die Bilder bestätigten, dass der entworfene Nanobody an den Rezeptor im aktiven Zustand band, was die Übereinstimmung mit dem Computermodell mit bemerkenswerter Präzision bestätigte. Die Struktur zeigte, dass die flexiblen Loops des Nanobody exakt die Form angenommen hatten, die im Design vorhergesagt wurde, und den Rezeptor in seiner aktiven Form fixierten.

Diese Experimente demonstrieren, dass die alte Trennung zwischen dem Entwurf einer Form und dem Entwurf einer Sequenz nicht mehr notwendig ist. Indem sie beide gemeinsam evolvieren lässt, kann GuideFlip Probleme bewältigen, die zuvor als zu schwierig galten, wie etwa das Binden an Proteine, die keine feste Form haben, oder das Erstellen von Bindern, die empfindlich auf subtile Änderungen in der Form eines Ziels reagieren. Die Forscher stellten auch fest, dass ihre Methode Proteine produzierte, die im Vergleich zu anderen Designansätzen, die auf einfacheren Optimierungstechniken beruhen, wahrscheinlicher löslich und stabil in einer Zelle sind. Während sich die Studie auf spezifische Proteine konzentrierte, ist das Framework allgemein genug, um auf andere Probleme der molekularen Erkennung angewendet zu werden. Die Fähigkeit, Proteine zu entwerfen, die flüchtige, flexible Interaktionen stabilisieren können, deutet auf eine neue Ära in der molekularen Konstruktion hin, in der Wissenschaftler Werkzeuge bauen können, um die dynamischsten Teile der zellulären Maschinerie einzufangen und zu kontrollieren.