De novo design of flexible protein interactions with GuideFlip

En el mundo microscópico de la biología, la vida a menudo depende de un delicado juego de reconocimiento molecular. Las proteínas, las máquinas de trabajo de la célula, deben encontrar y agarrarse a socios específicos para enviar señales, construir estructuras o combatir infecciones. Durante décadas, los científicos han entendido que muchas de estas interacciones se basan en un principio de llave y cerradura, donde una proteína rígida encaja perfectamente en un objetivo rígido. Sin embargo, la naturaleza es mucho más fluida de lo que sugiere esta imagen simple. Muchas proteínas cruciales son intrínsecamente desordenadas, lo que significa que no tienen una forma fija hasta que encuentran a su socio. Son como cuerdas enredadas que solo adoptan una forma específica una vez que se unen a algo más. Esta flexibilidad les permite realizar tareas complejas, como regular el crecimiento celular o responder al estrés, pero también las hace increíblemente difíciles de estudiar o diseñar. Los métodos tradicionales para diseñar nuevas proteínas suelen requerir un plano rígido preexistente del objetivo para poder trabajar. Cuando el objetivo es una cuerda que cambia de forma, estos métodos suelen fallar porque no hay una forma fija para la cual diseñar.

Un equipo de investigadores ha desarrollado ahora un nuevo enfoque llamado GuideFlip que resuelve este problema diseñando la proteína y su forma al mismo tiempo. En lugar de intentar forzar un diseño rígido sobre un objetivo flexible, este método permite que ambos evolucionen juntos. Los investigadores utilizaron este sistema para crear proteínas completamente nuevas que pueden agarrar los extremos desordenados de dos proteínas humanas importantes: una involucrada en la enfermedad de Parkinson y otra que controla la división celular. En pruebas de laboratorio, los nuevos diseños funcionaron con un éxito sorprendente. El equipo también utilizó la misma técnica para construir un anticuerpo diminuto que puede distinguir entre dos formas diferentes de un receptor cardíaco, uniéndose únicamente a la versión activa. Estos resultados muestran que es posible diseñar proteínas que pueden atrapar y estabilizar objetivos que no tienen una forma fija hasta que son atrapados, abriendo la puerta al tratamiento de enfermedades que antes estaban fuera del alcance de las terapias basadas en proteínas.

El desafío central que enfrentaron los investigadores fue que los programas informáticos estándar para el diseño de proteínas operan en dos pasos separados. Primero, generan una estructura de esqueleto rígida y, segundo, completan la secuencia de aminoácidos para ajustarse a esa forma. Esto funciona bien cuando el objetivo es un objeto sólido e inalterable. Pero cuando el objetivo es una proteína flexible y desordenada, el proceso de diseño se rompe. Si la computadora intenta diseñar un ligando para una forma que aún no existe, a menudo crea secuencias que no se parecen en nada a las proteínas naturales, favoreciendo cúmulos hidrofóbicos y grasientos que se agruparían en la célula en lugar de unirse a un objetivo. Los investigadores se dieron cuenta de que, para tener éxito, necesitaban un sistema donde la secuencia y la estructura pudieran influirse mutuamente de forma continua.

Para lograr esto, construyeron GuideFlip, un marco que utiliza una técnica llamada ajuste de flujo discreto guiado (guided discrete flow matching). Imagine intentar encontrar un camino a través de un bosque denso donde los árboles se mueven mientras usted camina. En lugar de mapear todo el bosque primero y luego caminar, GuideFlip da un paso, ve cómo se han desplazado los árboles y luego decide el siguiente paso basándose en esa nueva vista. En el modelo computacional, el sistema comienza con una suposición aleatoria de una secuencia de proteína. Luego predice cómo se plegaría y se uniría a la diana. Basándose en esa predicción, ajusta ligeramente la secuencia y luego predice la nueva forma nuevamente. Este ciclo se repite, con la secuencia y la estructura predicha evolucionando juntas. Una parte clave del sistema es un "guía" que mantiene el diseño con apariencia de una proteína real y soluble, evitando que se convierta en esos cúmulos grasientos e inútiles. Otra parte del sistema utiliza un potente motor de predicción de estructuras para asegurar que el ligando realmente encaje con el objetivo. Al combinar estas dos fuerzas, el sistema puede navegar por el complejo paisaje de las interacciones flexibles.

Los investigadores pusieron a prueba este método en dos objetivos difíciles. El primero fue el extremo final de una proteína llamada alfa-sinucleína. Esta proteína es famosa por agruparse en los cerebros de personas con la enfermedad de Parkinson. El extremo final está desordenado y nunca se ha visto con una forma fija, lo que lo convierte en una pesadilla para el diseño tradicional. El equipo pidió a GuideFlip que creara un ligando para esta región específica sin proporcionar ninguna forma preexistente. La computadora generó miles de diseños, que luego fueron filtrados para encontrar los candidatos más prometedores. Los investigadores sintetizaron los mejores candidatos y los probaron en el laboratorio. Encontraron que siete de los treinta y siete diseños se unieron con éxito al objetivo. Dos de estos, llamados dnAS15 y dnAS36, mostraron una unión fuerte. Para demostrar que se estaban uniendo al lugar correcto, el equipo acortó la proteína objetivo, eliminando el extremo final, y descubrió que los ligandos ya no se adherían. También utilizaron la resonancia magnética nuclear, una técnica que rastrea el movimiento de los átomos, para confirmar que los ligandos estaban, de hecho, agarrando la cola desordenada y estabilizándola en una forma específica.

La segunda prueba involucró una proteína llamada RBX1, que actúa como un interruptor para la división celular. Su sección inicial también es desordenada hasta que se une a una máquina más grande en la célula. Los investigadores diseñaron ligandos para esta sección inicial flexible. En una prueba de tipo competencia, sometieron sus diseños a un grupo independiente para su evaluación. Dos de sus diseños, dnRB1 y dnRB2, resultaron unirse fuertemente al objetivo. Una ronda posterior de diseño produjo un ligando aún más fuerte, dnRB8, que se mantuvo con una afinidad de 4.5 nanomolar, una medida de qué tan estrechamente se pegan dos moléculas. Para asegurar que estos ligandos estaban funcionando según lo previsto, el equipo mutó partes específicas del ligando y observó cómo la fuerza de unión disminuía, confirmando que el diseño había identificado correctamente los puntos de contacto.

El equipo también exploró si este método podría funcionar cuando la flexibilidad estaba del lado del ligando en lugar del objetivo. Se centraron en un receptor en el corazón llamado receptor beta-1 adrenérgico, que cambia de forma cuando recibe una señal. Querían crear un anticuerpo diminuto, llamado nanocuerpo, que solo se uniera al receptor cuando este se encontraba en su estado activo, "encendido", ignorando el estado inactivo, "apagado". Utilizando la estructura de un anticuerpo conocido como andamio, pidieron a GuideFlip que rediseñara los bucles flexibles que hacen contacto con el receptor. El sistema generó dieciséis nuevos diseños. Al probarlos, quince de ellos se expresaron bien en bacterias y doce de ellos se unieron al receptor solo cuando este era activado por una droga. Un diseño, NbIC20, se unió con alta afinidad. Los investigadores luego utilizaron criomicroscopía electrónica, un método que toma imágenes 3D de moléculas con resolución casi atómica, para ver exactamente cómo funcionaba. Las imágenes confirmaron que el nanocuerpo diseñado se unía al receptor en el estado activo, coincidiendo con el modelo computacional con una precisión notable. La estructura mostró que los bucles flexibles del nanocuerpo habían adoptado la forma exacta predicha por el diseño, bloqueando el receptor en su forma activa.

Estos experimentos demuestran que la antigua separación entre diseñar una forma y diseñar una secuencia ya no es necesaria. Al permitir que las dos evolucionen juntas, GuideFlip puede abordar problemas que anteriormente se consideraban demasiado difíciles, como unirse a proteínas que no tienen una forma fija o crear ligandos que sean sensibles a cambios sutiles en la forma de un objetivo. Los investigadores también señalaron que su método produjo proteínas que tienen más probabilidades de ser solubles y estables en una célula en comparación con otros enfoques de diseño que dependen de técnicas de optimización más simples. Aunque el estudio se centró en proteínas específicas, el marco es lo suficientemente general como para aplicarse a otros problemas de reconocimiento molecular. La capacidad de diseñar proteínas que pueden estabilizar interacciones flexibles y fugaces sugiere una nueva era en la ingeniería molecular, donde los científicos pueden construir herramientas para capturar y controlar las partes más dinámicas de la maquinaria celular.