De novo design of flexible protein interactions with GuideFlip

In de microscopische wereld van de biologie hangt het leven vaak af van een delicaat spel van moleculaire herkenning. Eiwitten, de werkpaarden van de cel, moeten specifieke partners vinden en vastpakken om signalen te sturen, structuren op te bouwen of infecties te bestrijden. Decennialang begrepen wetenschappers dat veel van deze interacties steunen op een slot-en-sleutelprincipe, waarbij een rigide eiwit perfect past in een rigide doelwit. De natuur is echter veel vloeibaarder dan dit eenvoudige beeld suggereert. Veel cruciale eiwitten zijn intrinsiek ongeordend, wat betekent dat ze geen vaste vorm hebben totdat ze hun partner ontmoeten. Ze zijn als verstrengelde touwen die pas in een specifieke vorm springen zodra ze aan iets anders binden. Deze flexibiliteit stelt hen in staat complexe taken uit te voeren, zoals het reguleren van celgroei of het reageren op stress, maar het maakt ze ook ongelooflijk moeilijk te bestuderen of te ontwerpen. Traditionele methoden voor het ontwerpen van nieuwe eiwitten vereisen meestal een bestaand, rigide blauwdruk van het doelwit om tegen te werken. Wanneer het doelwit een vormveranderende draad is, falen deze methoden vaak omdat er geen vaste vorm is om voor te ontwerpen.

Een team van onderzoekers heeft nu een nieuwe aanpak ontwikkeld genaamd GuideFlip die dit probleem oplost door het eiwit en de vorm ervan tegelijkertijd te ontwerpen. In plaats van te proberen een rigide ontwerp op een flexibel doelwit te dwingen, laat deze methode de twee samen evolueren. De onderzoekers gebruikten dit systeem om gloednieuwe eiwitten te creëren die de ongeordende uiteinden van twee belangrijke menselijke eiwitten kunnen vastpakken: één betrokken bij de ziekte van Parkinson en een ander die de celdeling reguleert. In laboratoriumtests werkten de nieuwe ontwerpen met verrassend groot succes. Het team gebruikte dezelfde techniek ook om een piepklein antilichaam te bouwen dat tussen twee verschillende vormen van een hartreceptor kan onderscheiden, waarbij het alleen bindt aan de actieve versie. Deze resultaten tonen aan dat het mogelijk is om eiwitten te ontwerpen die doelwitten kunnen vangen en stabiliseren die geen vaste vorm hebben totdat ze gevangen zijn, wat de deur opent naar de behandeling van ziekten die voorheen buiten bereik waren voor eiwitgebaseerde therapieën.

De kernuitdaging waar de onderzoekers voor stonden, was dat standaard computerprogramma's voor eiwitontwerp in twee afzonderlijke stappen werken. Eerst genereren ze een rigide ruggengraatstructuur, en daarna vullen ze de aminozuursequentie in om bij die vorm te passen. Dit werkt goed wanneer het doelwit een solide, onveranderlijk object is. Maar wanneer het doelwit een slappe, ongeordende eiwit is, stort het ontwerpproces in. Als de computer probeert een binder te ontwerpen voor een vorm die nog niet bestaat, creëert het vaak sequenties die totaal niet lijken op natuurlijke eiwitten, waarbij de voorkeur wordt gegeven aan vettige, hydrofobe klonters die in een cel zouden samenklonteren in plaats van aan een doelwit te binden. De onderzoekers realiseerden zich dat ze, om succesvol te zijn, een systeem nodig hadden waarin de sequentie en de structuur continu invloed op elkaar konden uitoefenen.

Om dit te bereiken, bouwden ze GuideFlip, een framework dat gebruikmaakt van een techniek genaamd 'guided discrete flow matching'. Stel je voor dat je een pad probeert te vinden door een dicht bos waar de bomen bewegen terwijl je loopt. In plaats van eerst het hele bos in kaart te brengen en dan te lopen, zet GuideFlip een stap, ziet hoe de bomen zijn verschoven, en beslist dan de volgende stap op basis van dat nieuwe uitzicht. In het computermodel begint het systeem met een willekeurige gok van een eiwitsequentie. Vervolgens voorspelt het hoe die sequentie zou vouwen en binden aan het doelwit. Op basis van die voorspelling past het de sequentie licht aan, waarna het de nieuwe vorm opnieuw voorspelt. Deze cyclus herhaalt zich, waarbij de sequentie en de voorspelde structuur samen evolueren. Een essentieel onderdeel van het systeem is een "gids" die ervoor zorgt dat het ontwerp eruitziet als een echt, oplosbaar eiwit, om te voorkomen dat het verandert in die nutteloze, vettige klonters. Een ander deel van het systeem gebruikt een krachtige structuurvoorspellingsmotor om te garanderen dat de binder daadwerkelijk op het doelwit past. Door deze twee krachten te combineren, kan het systeem navigeren door het complexe landschap van flexibele interacties.

De onderzoekers testten deze methode op twee moeilijke doelwitten. De eerste was het uiteinde van een eiwit genaamd alfa-synucleïne. Dit eiwit staat bekend om het klonteren in de hersenen van mensen met de ziekte van Parkinson. Het uiteinde is ongeordend en is nooit in een vaste vorm gezien, wat het een nachtmerrie maakt voor traditioneel ontwerp. Het team vroeg GuideFlip om een binder te creëren voor dit specifieke gebied zonder een vooraf bestaande vorm te verstrekken. De computer genereerde duizenden ontwerpen, die vervolgens werden gefilterd om de meest veelbelovende kandidaten te vinden. De onderzoekers synthetiseerden de beste kandidaten en testten deze in het lab. Ze vonden dat zeven van de zevenendertig ontwerpen succesvol bonden aan het doelwit. Twee hiervan, genaamd dnAS15 en dnAS36, vertoonden een sterke binding. Om te bewijzen dat ze aan de juiste plek bonden, verkortten het team het doelwit-eiwit door het uiteinde te verwijderen, en merkten zij dat de binders niet langer hechtten. Ze gebruikten ook kernmagnetische resonantie, een techniek die de beweging van atomen volgt, om te bevestigen dat de binders inderdaad de ongeordende staart grepen en deze in een specifieke vorm stabiliseerden.

De tweede test betrof een eiwit genaamd RBX1, dat fungeert als een schakelaar voor celdeling. Het begingedeelte is ook ongeordend totdat het bindt aan een grotere machine in de cel. De onderzoekers ontwierpen binders voor dit slappe begingedeelte. In een competitie-achtige test leverden ze hun ontwerpen in bij een onafhankelijke groep voor evaluatie. Twee van hun ontwerpen, dnRB1 en dnRB2, bleken stevig aan het doelwit te binden. Een daaropvolgende ronde van ontwerp produceerde een nog sterkere binder, dnRB8, die vasthield met een affiniteit van 4,5 nanomolair, een maatstaf voor hoe nauw twee moleculen aan elkaar plakken. Om te verzekeren dat deze binders volgens de bedoeling werkten, muteerden het team specifieke delen van de binder en observeerden zij de daling in bindingssterkte, wat bevestigde dat het ontwerp de contactpunten correct had geïdentificeerd.

Het team onderzocht ook of deze methode kon werken wanneer de flexibiliteit aan de kant van de binder zat in plaats van aan de kant van het doelwit. Ze richtten zich op een receptor in het hart, de bèta-1-adrenerge receptor, die van vorm verandert wanneer hij een signaal ontvangt. Ze wilden een piepklein antilichaam, een nanobody genoemd, creëren dat alleen aan de receptor bindt wanneer deze in de actieve, "aan"-stand staat, en de inactieve "uit"-stand negeert. Gebruikmakend van een bekende antilichaamstructuur als steiger, vroegen ze GuideFlip om de flexibele lussen die contact maken met de receptor te herontwerpen. Het systeem genereerde zestien nieuwe ontwerpen. Bij testen bleken vijftien van hen goed tot expressie te komen in bacteriën, en twaalf van hen bonden alleen aan de receptor wanneer deze werd geactiveerd door een medicijn. Eén ontwerp, NbIC20, bond met een hoge affiniteit. De onderzoekers gebruikten vervolgens cryo-elektronenmicroscopie, een methode die 3D-beelden van moleculen vastlegt met bijna atomaire resolutie, om precies te zien hoe het werkte. De beelden bevestigden dat de ontworpen nanobody bond aan de receptor in de actieve staat, wat overeenkwam met het computermodel met opmerkelijke precisie. De structuur toonde aan dat de flexibele lussen van de nanobody exact de vorm hadden aangenomen die door het ontwerp werd voorspeld, waardoor de receptor in zijn actieve vorm werd vergrendeld.

Deze experimenten demonstreren dat de oude scheiding tussen het ontwerpen van een vorm en het ontwerpen van een sequentie niet langer noodzakelijk is. Door de twee samen te laten evolueren, kan GuideFlip problemen aanpakken die voorheen als te moeilijk werden beschouwd, zoals het binden aan eiwitten die geen vaste vorm hebben of het creëren van binders die gevoelig zijn voor subtiele veranderingen in de vorm van een doelwit. De onderzoekers merkten ook op dat hun methode eiwitten produceerde die meer geneigd waren tot oplosbaarheid en stabiliteit in een cel vergeleken met andere ontwerpaanpakken die vertrouwen op eenvoudigere optimalisatietechnieken. Hoewel de studie zich richtte op specifieke eiwitten, is het framework algemeen genoeg om te worden toegepast op andere problemen van moleculaire herkenning. Het vermogen om eiwitten te ontwerpen die vluchtige, flexibele interacties kunnen stabiliseren, suggereert een nieuw tijdperk in de moleculaire engineering, waarin wetenschappers instrumenten kunnen bouwen om de meest dynamische delen van de cellulaire machinerie te vangen en te beheersen.