De novo design of flexible protein interactions with GuideFlip

Nel mondo microscopico della biologia, la vita dipende spesso da un delicato gioco di riconoscimento molecolare. Le proteine, i motori della cellula, devono trovare e aggrapparsi a partner specifici per inviare segnali, costruire strutture o combattere infezioni. Per decenni, gli scienziati hanno compreso che molte di queste interazioni si basano sul principio della chiave e della serratura, in cui una proteina rigida si incastra perfettamente in un bersaglio rigido. Tuttavia, la natura è molto più fluida di questa semplice immagine suggerisce. Molte proteine cruciali sono intrinsecamente disordinate, il che significa che non hanno una forma fissa finché non incontrano il loro partner. Sono come fili aggrovigliati che assumono una forma specifica solo una volta legati a qualcos'altro. Questa flessibilità permette loro di svolgere compiti complessi, come regolare la crescita cellulare o rispondere allo stress, ma rende anche estremamente difficile studiarle o ingegnerizzarle. I metodi tradizionali per progettare nuove proteine richiedono solitamente un modello preesistente e rigido del bersaglio su cui lavorare. Quando il bersaglio è un filo che cambia forma, questi metodi spesso falliscono perché non esiste una forma fissa per cui progettare.

Un team di ricercatori ha sviluppato un nuovo approccio chiamato GuideFlip che risolve questo problema progettando la proteina e la sua forma contemporaneamente. Invece di cercare di imporre un design rigido a un bersaglio flessibile, questo metodo permette ai due di evolversi insieme. I ricercatori hanno usato questo sistema per creare proteine completamente nuove in grado di aggrapparsi alle estremità disordinate di due importanti proteine umane: una coinvolta nella malattia di Parkinson e un'altra che controlla la divisione cellulare. Nei test di laboratorio, i nuovi design hanno funzionato con sorprendente successo. Il team ha anche utilizzato la stessa tecnica per costruire un minuscolo anticorpo capace di distinguere tra due diverse forme di un recettore cardiaco, legandosi solo alla versione attiva. Questi risultati dimostrano che è possibile ingegnerizzare proteine che possono catturare e stabilizzare bersagli che non hanno una forma fissa finché non vengono catturati, aprendo la porta al trattamento di malattie che erano precedentemente fuori portata per le terapie basate sulle proteine.

La sfida centrale che i ricercatori hanno affrontato è che i normali programmi informatici per la progettazione delle proteine operano in due fasi separate. Prima, generano una struttura di base rigida e, in secondo luogo, riempiono la sequenza amminoacidica per adattarsi a quella forma. Questo funziona bene quando il bersaglio è un oggetto solido e immutabile. Ma quando il bersolo è una proteina floscia e disordinata, il processo di progettazione si interrompe. Se il computer prova a progettare un legante per una forma che non esiste ancora, spesso crea sequenze che non somigliano affatto alle proteine naturali, favorendo ammassi idrofobici e untuosi che si aggregherebbero in una cellula invece di legarsi a un bersaglio. I ricercatori hanno capito che, per avere successo, avevano bisogno di un sistema in cui la sequenza e la struttura potessero influenzarsi a vicenda continuamente.

Per raggiungere questo obiettivo, hanno costruito GuideFlip, un framework che utilizza una tecnica chiamata "guided discrete flow matching" (corrispondenza di flusso discreto guidata). Immaginate di cercare di trovare un sentiero attraverso una foresta densa dove gli alberi si muovono mentre camminate. Invece di mappare prima l'intera foresta e poi camminare, GuideFlip compie un passo, vede come gli alberi si sono spostati e poi decide il passo successivo in base a questa nuova visuale. Nel modello informatico, il sistema parte da un tentativo casuale di sequenza proteica. Poi prevede come quella sequenza si ripiegherebbe e si legherebbe al bersaglio. In base a questa previsione, modifica leggermente la sequenza, poi prevede nuovamente la nuova forma. Questo ciclo si ripete, con la sequenza e la struttura prevista che evolvono insieme. Una parte fondamentale del sistema è una "guida" che mantiene il design simile a una proteina reale e solubile, impedendo che si trasformi in quegli inutili ammassi untuosi. Un'altra parte del sistema utilizza un potente motore di predizione strutturale per garantire che il legante si adatti effettivamente al bersaglio. Combinando queste due forze, il sistema può navigare nel complesso panorama delle interazioni flessibili.

I ricercatori hanno messo alla prova questo metodo su due bersagli difficili. Il primo era l'estremità terminale di una proteina chiamata alfa-sinucleina. Questa proteina è famosa per l'aggregazione nei cervelli delle persone affette da Parkinson. L'estremità terminale è disordinata e non è mai stata vista in una forma fissa, rendendola un incubo per la progettazione tradizionale. Il team ha chiesto a GuideFlip di creare un legante per questa regione specifica senza fornire alcuna forma preesistente. Il computer ha generato migliaoli di design, che sono stati poi filtrati per trovare i candidati più promettenti. I ricercatori hanno sintetizzato i migliori candidati e li hanno testati in laboratorio. Hanno scoperto che sette su trentasette design si legavano con successo al bersaglio. Due di questi, chiamati dnAS15 e dnAS36, hanno mostrato un forte legame. Per dimostrare che si legavano al punto giusto, il team ha accorciato la proteina bersaglio, rimuovendo l'estremità terminale, e ha scoperto che i leganti non si attaccavano più. Hanno anche utilizzato la risonanza magnetica nucleare, una tecnica che traccia il movimento degli atomi, per confermare che i leganti stavano effettivamente afferrando la coda disordinata e stabilizzandola in una forma specifica.

Il secondo test ha coinvolto una proteina chiamata RBX1, che agisce come uno switch per la divisione cellulare. La sua sezione iniziale è anch'essa disordinata finché non si lega a una macchina più grande nella cellula. I ricercatori hanno progettato dei leganti per questa parte iniziale floscia. In un test in stile competizione, hanno sottoposto i loro design a un gruppo indipendente per la valutazione. Due dei loro design, dnRB1 e dnRB2, si sono rivelati capaci di legarsi strettamente al bersaglio. Un ulteriore round di progettazione ha prodotto un legante ancora più forte, dnRB8, che si è aggrappato con un'affinità di 4,5 nanomolare, una misura di quanto strettamente due molecole si uniscano. Per assicurarsi che i leganti funzionassero come previsto, il team ha mutato parti specifiche del legante e ha osservato la diminuzione della forza di legame, confermando che il design aveva identificato correttamente i punti di contatto.

Il team ha anche esplorato se questo metodo potesse funzionare quando la flessibilità era dal lato del legante piuttosto che del bersaglio. Si sono concentrati su un recettore nel cuore, il recettore beta-1 adrenergico, che cambia forma quando riceve un segnale. Volevano creare un minuscolo anticorpo, chiamato nanobody, che si leghi al recettore solo quando è nel suo stato attivo, "on", ignorando lo stato inattivo "off". Utilizzando una struttura di anticorpo nota come impalcatura, hanno chiesto a GuideFlip di riprogettare i loop flessibili che fanno contatto con il recettore. Il sistema ha generato sedici nuovi design. Quando testati, quindici di essi si sono espressi bene nei batteri e dodici si legavano al recettore solo quando questo veniva attivato da una droga. Un design, NbIC20, si legava con alta affinità. I ricercatori hanno poi utilizzato la criomicroscopia elettronica, un metodo che scatta foto 3D delle molecole a una risoluzione quasi atomica, per vedere esattamente come funzionava. Le immagini hanno confermato che il nanobody progettato si legava al recettore nello stato attivo, corrispondendo al modello informatico con straordinaria precisione. La struttura mostrava che i loop flessibili del nanobody avevano assunto l'esatta forma prevista dal design, bloccando il recettore nella sua forma attiva.

Questi esperimenti dimostrano che la vecchia separazione tra la progettazione di una forma e la progettazione di una sequenza non è più necessaria. Lasciando che le due evolvano insieme, GuideFlip può affrontare problemi che erano precedentemente considerati troppo difficili, come il legame con proteine che non hanno una forma fissa o la creazione di leganti sensibili ai sottili cambiamenti nella forma di un bersaglio. I ricercatori hanno anche notato che il loro metodo produceva proteine più propense a essere solubili e stabili in una cella rispetto ad altri approcci di progettazione che si affidano a tecniche di ottimizzazione più semplici. Sebbene lo studio si sia concentrato su specifiche proteine, il framework è abbastanza generale da poter essere applicato ad altri problemi di riconoscimento molecolare. La capacità di progettare proteine che possono stabilizzare interazioni flessibili e fugaci suggerisce una nuova era nell'ingegneria molecolare, in cui gli scienziati possono costruire strumenti per catturare e controllare le parti più dinamiche del macchinario cellulare.